革蘭染色失敗的5個常見原因及排查方法！

革蘭染色是微生物學中最基礎、最重要的細菌鑒別方法之一，其結果直接影響后續的細菌鑒定和治療方案。若操作不當，容易導致染色失敗，出現假陽性或假陰性結果。以下是革蘭染色失敗的5個常見原因及相應的排查方法：

1. 脫色時間控制不當

• 問題表現：

• 脫色過久 → 革蘭陽性菌被誤判為陰性（假陰性）；
• 脫色不足 → 革蘭陰性菌被誤判為陽性（假陽性）。

• 原因分析：
  脫色劑（通常為95%乙醇或丙酮-乙醇混合液）作用時間對染色結果影響極大。

• 排查與改進：

• 嚴格控制脫色時間（一般為10–30秒，視試劑濃度和室溫調整）；
• 建議采用“滴加法”觀察流下的液體是否無色，一旦無色立即停止脫色；
• 可用已知陽性（如金黃色葡萄球菌）和陰性（如大腸桿菌）菌株作為對照。

2. 細菌培養時間不當

• 問題表現：老齡培養物中革蘭陽性菌可能失去保留結晶紫的能力，呈現假陰性。

• 原因分析：細菌在進入衰亡期后細胞壁結構受損，通透性改變。

• 排查與改進：

• 使用18–24小時的新鮮培養物進行染色；
• 避免使用超過48小時的培養物；
• 若必須使用陳舊培養物，應結合其他鑒定方法確認。

3. 涂片過厚或固定不當

• 問題表現：染色不均、背景深、難以觀察形態，甚至出現假陽性聚集。

• 原因分析：過厚的涂片阻礙染料滲透和脫色劑作用；熱固定過度會破壞細胞結構。

• 排查與改進：

• 制備薄而均勻的涂片（透光下隱約可見）；
• 熱固定時玻片背面輕觸火焰2–3次即可，避免持續烘烤；
• 可改用甲醇固定（尤其適用于苛養菌）。

4. 試劑失效或配制錯誤

• 問題表現：整體染色效果差，顏色模糊，陰陽性界限不清。

• 原因分析：結晶紫、碘液、脫色劑或復染劑（如沙黃/番紅）變質、濃度過低或污染。

• 排查與改進：

• 定期更換試劑（尤其脫色劑易揮發失效）；
• 使用前檢查試劑澄清度和有效期；
• 自配試劑需嚴格按照標準配方（如Gram’s碘液含碘1g、碘化鉀2g、蒸餾水300mL）；
• 建議每周用標準菌株做質控。

5. 沖洗操作不當

• 問題表現：染色不均、細胞脫落、背景殘留染料干擾判斷。

• 原因分析：沖洗水流過猛沖走細菌，或沖洗不充分導致染料殘留。

• 排查與改進：

• 使用細緩水流從玻片背面沖洗，避免直接沖擊涂片面；
• 每步染色后充分但輕柔沖洗，直至流下水清澈；
• 可用洗瓶控制水流方向和壓力。

補充建議：

• 設立陽性和陰性對照：每次染色都應同時處理已知革蘭陽性（如 Staphylococcus aureus）和陰性（如 Escherichia coli）菌株；

• 標準化操作流程（SOP）：制定并培訓統一的操作規范；

• 顯微鏡校準：確保油鏡清潔、光源適當，避免因觀察條件導致誤判。

通過系統排查上述環節，可顯著提高革蘭染色的準確性和重復性。