標(biāo)準(zhǔn)菌株怎么傳代才不退化？保藏與復(fù)蘇關(guān)鍵步驟
為確保標(biāo)準(zhǔn)菌株在傳代過(guò)程中不發(fā)生退化、污染或變異，必須嚴(yán)格遵循規(guī)范的活化—傳代—保藏—復(fù)蘇流程。以下是基于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（如《SN/T 2660-2010》《GB 4789.28-2013》等）和實(shí)驗(yàn)室最佳實(shí)踐總結(jié)的關(guān)鍵操作要點(diǎn)：
一、防止菌株退化的關(guān)鍵原則
1、嚴(yán)格控制傳代次數(shù)
標(biāo)準(zhǔn)菌株從保藏中心獲得為 0代；
首次活化后制備的冷凍保存株為 第1代（儲(chǔ)備菌株）；
工作菌株通常使用 第2–4代；
嚴(yán)禁超過(guò)5代使用，除非有完整的生化/分子驗(yàn)證證明未變異。
2、避免反復(fù)凍融與頻繁傳代
每次使用應(yīng)從同一支冷凍儲(chǔ)備管中取用，避免多次解凍同一管；
儲(chǔ)備菌株只用于制備工作菌株，不直接用于實(shí)驗(yàn)。
3、使用合適保藏方法延長(zhǎng)穩(wěn)定性
推薦：甘油管（-80℃）、凍干粉、瓷珠法；
短期可用：斜面+液體石蠟（4℃，1–3個(gè)月），但需定期轉(zhuǎn)接。
4、保持培養(yǎng)條件一致性
使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（如LB、營(yíng)養(yǎng)瓊脂等）；
避免在單一培養(yǎng)基上連續(xù)多代傳代，可輪換不同類型培養(yǎng)基（尤其對(duì)食用菌或工業(yè)菌種）。
二、標(biāo)準(zhǔn)菌株傳代規(guī)范流程
步驟1：接收與建檔
建立菌株管理臺(tái)賬：記錄來(lái)源（如ATCC/CMCC）、編號(hào)、接收日期、代數(shù)、保存方式等。
步驟2：首次活化（0代 → 1代）
按說(shuō)明書(shū)復(fù)蘇（如凍干管加無(wú)菌水、甘油管劃線等）；
接種至非選擇性培養(yǎng)基（如TSA、NA），適宜溫度培養(yǎng)；
挑取單菌落進(jìn)行純化（確保無(wú)雜菌）。
步驟3：“體檢”驗(yàn)證
形態(tài)觀察：菌落大小、顏色、邊緣是否一致；
革蘭氏染色：確認(rèn)細(xì)胞形態(tài)與預(yù)期一致；
生化試驗(yàn)（如氧化酶、糖發(fā)酵等）：驗(yàn)證典型特性；
必要時(shí)做分子鑒定（如16S rRNA測(cè)序）。
步驟4：制備儲(chǔ)備菌株（1代）
制成甘油終濃度15–20%的菌懸液（細(xì)胞濃度約10?–101? CFU/mL）；
分裝至無(wú)菌凍存管，-80℃超低溫冰箱保存；
或制成凍干粉、沙土管等長(zhǎng)期保藏形式。
甘油管配制示例：
配40% (v/v) 甘油水溶液，121℃滅菌；
取500 μL甘油液 + 500 μL新鮮菌液 → 混勻 → -80℃保存。
步驟5：工作菌株制備（1代 → 2–4代）
從1代儲(chǔ)備管快速解凍（手握或37℃水浴<1分鐘）；
立即接種至新鮮培養(yǎng)基活化；
再次驗(yàn)證純度與特性；
可直接用于實(shí)驗(yàn)，或短期4℃斜面保存（≤1個(gè)月）。
三、菌種復(fù)蘇關(guān)鍵步驟（以甘油管為例）
無(wú)菌操作：全程在超凈工作臺(tái)進(jìn)行；
快速解凍：避免冰晶損傷細(xì)胞；
立即接種：解凍后不可放置，應(yīng)立刻劃線或接入液體培養(yǎng)基；
適宜培養(yǎng)：按菌種要求設(shè)置溫度、時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速（如37℃, 180 rpm, 12–16 h）；
驗(yàn)證復(fù)蘇效果：觀察生長(zhǎng)狀態(tài)、純度、典型特征。
四、銷毀與記錄
污染、老化、超代菌株必須高壓滅菌（121℃, 30 min）后丟棄；
所有操作（活化、傳代、使用、銷毀）均需詳細(xì)記錄于菌株臺(tái)賬，包括：日期、操作人、代數(shù)、培養(yǎng)基、驗(yàn)證結(jié)果、用途、保存位置等。
