標準菌株反復凍融的風險與規范化管理指南！
標準菌株是微生物檢測、方法驗證、質量控制及科研工作的“基準尺”，其遺傳穩定性、生理活性和純度直接關系到實驗結果的可靠性。因此，反復凍融（即多次冷凍-解凍）對標準菌株的影響不容忽視，必須通過科學規范的管理加以規避。
一、反復凍融對標準菌株的主要負面影響
1. 細胞結構損傷與存活率顯著下降
冰晶形成：冷凍過程中胞內外水分結晶，刺穿細胞膜/壁，導致內容物泄漏。
滲透壓沖擊：解凍時水分快速進入細胞，造成膨脹破裂；或脫水導致代謝停滯。
敏感菌株尤甚：如乳酸菌、雙歧桿菌、厭氧菌、奈瑟氏菌等，1–2次凍融即可損失50%以上活菌數。
2. 遺傳物質不穩定，表型漂變
凍融過程誘發氧化應激，產生自由基，損傷DNA。
可能導致：
基因突變或缺失
質粒丟失（影響抗性、產酶等特性）
表型改變（如生化反應異常、生長速率下降）
長期反復操作將使菌株偏離原始標準特性，喪失“標準”意義。
3. 污染與交叉污染風險升高
每次取用均需開蓋操作，增加環境微生物、氣溶膠或操作者帶入雜菌的風險。
若未嚴格分區操作，不同菌株間可能發生交叉污染，導致鑒定錯誤。
4. 功能活性退化
關鍵酶（如β-半乳糖苷酶、過氧化氫酶）活性下降。
代謝產物（如有機酸、細菌素）合成能力減弱。
對于用于抗生素效價測定或藥敏試驗的菌株，可能導致假陰性或MIC偏移。
二、標準菌株規范管理的核心措施
1. “一次性分裝”原則
初次復蘇后，將菌懸液與保護劑（如20%甘油）等體積混合。
分裝至0.5–1 mL/管的無菌凍存管中。
每管僅使用一次，嚴禁“用不完再凍回”。
2. 選擇適宜的凍存條件
| 菌種類型 | 推薦保護劑 | 凍存溫度 | 解凍方式 |
|---|---|---|---|
多數細菌 | 15–20% 甘油 | –80℃ 或液氮 | 37℃水浴快速融化 |
苛養菌/厭氧菌 | 脫脂牛奶、海藻糖 | 液氮更佳 | 冰上緩慢解凍 |
真菌/酵母 | 10% DMSO + 甘油 | –80℃ | 室溫或37℃ |
3. 建立三級菌種庫體系
主種子批（Master Seed Lot）：原始標準菌株，永不直接使用，僅用于制備工作種子。
工作種子批（Working Seed Lot）：由主種子批傳代1–2次后分裝，用于日常實驗。
使用級菌液：由工作種子批當日制備，當日用完，不保存。
4. 嚴格記錄與可追溯性
每支凍存管標簽應包含：
菌株名稱與編號（如ATCC 25922）
凍存日期與代次（P1, P2…）
操作人、保護劑類型
累計凍融次數（建議在電子臺賬中記錄）
5. 定期復核與報廢機制
每6–12個月對庫存菌株進行復蘇驗證：
形態（革蘭染色、鏡檢）
純度（劃線無雜菌）
生化特性（如API鑒定）
功能驗證（如藥敏、產酸）
若出現特性偏離、活力下降或污染，立即隔離并報廢。
三、權威依據與行業共識
《中國藥典》2020年版：明確要求標準菌株應“避免反復凍融”，建議采用“小量分裝、單次使用”。
ISO/IEC 17025：強調標準物質（含菌株）的穩定性監控與使用控制。
CLSI M22-A3：指出反復凍融可能導致藥敏質控菌株MIC漂移，影響質控結果判斷。
ATCC官方指南：建議用戶收到凍干粉后，自行擴增并分裝至少20管以上，以減少主庫存使用頻率。
通過科學分裝、嚴格操作、規范記錄和定期驗證，可最大限度避免反復凍融帶來的風險，確保標準菌株在檢測、科研和生產中持續發揮“金標準”作用。
