“菌落蔓延”毀掉整個平板？預(yù)防與補救指南！

菌落蔓延確實是微生物實驗中的“噩夢”。別擔(dān)心，針對這個老大難問題，有效的預(yù)防策略和發(fā)生后的補救方法都很明確。

通常，蔓延是以下一個或多個因素共同作用的結(jié)果：

主要原因	具體表現(xiàn)
樣品特性	樣品中含有變形桿菌等運動性極強的細(xì)菌。
操作問題	1. 稀釋液或樣品干涸：傾注前等待過久，導(dǎo)致菌體成團。2. 混合不勻：傾注后未充分搖勻，局部菌塊過多。3. 涂布菌液過多：菌液過量導(dǎo)致菌落生長空間不足，相互擠壓。
培養(yǎng)環(huán)境	1. 濕度過高：冷凝水過多，細(xì)菌易隨水流動擴散。2. 正置培養(yǎng)：某些標(biāo)準(zhǔn)（如霉菌檢測）要求正置時，蓋子上的冷凝水滴落易導(dǎo)致蔓延。
培養(yǎng)基問題	未使用抑制蔓延的添加劑。

預(yù)防的核心是“控制水分、阻止擴散、優(yōu)化操作”。

1. 核心操作流程優(yōu)化

及時傾注與混勻：樣品稀釋后，在30分鐘內(nèi)完成傾注并立即搖勻，防止菌體聚集。
確保平板干燥：傾注前，將空平皿在潔凈工作臺內(nèi)倒置晾干；傾注凝固后，可置于37℃烘箱短時烘干，或倒置于超凈工作臺內(nèi)吹干表面冷凝水。
堅持倒置培養(yǎng)：除非標(biāo)準(zhǔn)強制要求正置（如霉菌檢驗），否則一律采用倒置培養(yǎng)，這是防止冷凝水滴落導(dǎo)致蔓延的最基本措施。

2. 抑制蔓延的物理與化學(xué)方法
當(dāng)懷疑樣品中含有易蔓延菌時，可主動采用以下方法：

瓊脂覆蓋法（推薦）：在已凝固的培養(yǎng)基表面，再覆蓋一薄層（約4mL）無菌瓊脂。這層瓊脂能限制好氧菌的表面遷移，并固定已生長的菌落。研究證實此法能顯著減少蔓延。
使用TTC：在培養(yǎng)基中加入適量TTC（氯化三苯基四氮唑）。細(xì)菌生長時會將其還原為紅色，不僅便于觀察，TTC本身也有一定抑制蔓延的作用。
加蓋陶瓦蓋：在培養(yǎng)皿上蓋內(nèi)部加上一個無菌的陶瓦蓋，可以吸收冷凝水。但需注意，此法可能導(dǎo)致平板邊緣干裂。

3. 針對霉菌等特殊微生物的防控
霉菌檢測常需正置培養(yǎng)，污染和孢子擴散風(fēng)險更高。

如果預(yù)防失敗，仍可嘗試對平板進行挽救性計數(shù)：

選擇可計數(shù)區(qū)域：仔細(xì)觀察，嘗試計數(shù)蔓延區(qū)域邊緣的分散、獨立菌落。
覆蓋瓊脂固定法：若菌落仍在表層擴散，可將已蔓延的平板在生物安全柜中打開，小心倒入一層冷卻至45-50℃的無菌瓊脂，覆蓋原有菌落。凝固后，下層被固定的菌落將停止蔓延，便于計數(shù)。
判斷與報告：
若蔓延面積超過平板面積的1/2，或經(jīng)補救仍無法準(zhǔn)確計數(shù)，應(yīng)舍棄該平板數(shù)據(jù)。

在實驗記錄和報告中，需明確注明“存在蔓延生長”，并說明計數(shù)方法或舍棄原因，以保證數(shù)據(jù)的真實性和可追溯性。

生物安全：所有發(fā)生蔓延、疑似污染或已結(jié)束培養(yǎng)的平板，都必須經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后，再交由專業(yè)機構(gòu)處理，不可隨意丟棄。
結(jié)果有效性：若所有平行平板均因蔓延而無法計數(shù)，本次實驗數(shù)據(jù)無效，必須從樣品稀釋重新開始實驗。

總的來說，解決菌落蔓延的關(guān)鍵在于嚴(yán)格規(guī)范操作以預(yù)防，并掌握覆蓋瓊脂等有效的抑制與補救技術(shù)。根據(jù)你的具體實驗（如常規(guī)菌落總數(shù)計數(shù)、霉菌酵母計數(shù)或

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化涂板），側(cè)重點會有所不同。