Northern Blot原理及實(shí)驗(yàn)方法
原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。
用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。
實(shí)驗(yàn)方法：
[儀器、試劑、材料]
（一）儀器
恒溫水浴箱，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，真空轉(zhuǎn)移儀，真空泵，UV 交聯(lián)儀，雜交爐，恒溫?fù)u床，脫色搖床，漩渦振蕩器，分光光度計(jì)，微量移液器，電爐（或微波爐），離心管，燒杯，量筒，三角瓶，等。
（二）材料
總RNA樣品或mRNA樣品，探針模板DNA(25 ng)，尼龍膜
（三）試劑
NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），瓊脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，雙氧水, 滅菌水等。
[方法與步驟]
1. 用具的準(zhǔn)備：
180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時(shí)。
電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，干燥備用。
處理DEPC水(2 L)備用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。
3．制膠：
1)． 稱取0.36mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分)
2)． 在通風(fēng)廚中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，輕輕振蕩混勻。
注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。
3)． 將熔膠倒入制膠板中，插上梳子
如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或?qū)馀萃频侥z的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5cm。
4)．膠在室溫下完全凝固后，將膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm，小心拔出梳子。（配制250ml 1＊MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補(bǔ)充蒸發(fā)的buffer。）
5)．檢查點(diǎn)樣孔。
4. RNA樣品的制備
在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當(dāng)?shù)腅B（終濃度為10ug/ml）?；靹蚝?，65℃空氣浴15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5min。
5. 電泳：
1). 將RNA樣品小心加到點(diǎn)樣孔中。
2). 在5V/cm下跑膠（5ｘ14cm）。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液后繼續(xù)電泳。當(dāng)膠中的溴紛藍(lán)（500bp）接近膠的邊緣時(shí)終止電泳。
3). 紫外燈下，檢驗(yàn)電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍(lán)到點(diǎn)樣孔的距離。
注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時(shí)間
