WB 曝光原理
Western Blot (WB) 作為核心的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，其原理建立在抗原-抗體特異性結(jié)合之上。從蛋白經(jīng)PAGE電泳按分子量精確分離，到高效轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜，再到一抗通過Fab區(qū)CDR精準(zhǔn)鎖定目標(biāo)表位，二抗結(jié)合Fc段并攜帶HRP/AP等標(biāo)記酶放大信號(hào)，最終通過酶促顯色（如DAB沉淀）或化學(xué)發(fā)光（如HRP-魯米諾、AP-CDP Star系統(tǒng)）實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的可視化——每一步都環(huán)環(huán)相扣，精密嚴(yán)謹(jǐn)。
然而，曝光結(jié)果不佳時(shí)，除了常規(guī)的抗體效價(jià)、轉(zhuǎn)膜效率、封閉充分性等因素，翻譯后修飾（PTMs）常成為被忽視的“幕后推手”。磷酸化、糖基化、乙酰化等PTMs可顯著改變蛋白質(zhì)的：
分子量與遷移率：導(dǎo)致條帶位置異常，偏離預(yù)期。
構(gòu)象與表位可及性：關(guān)鍵抗原表位可能被修飾基團(tuán)遮蔽或改變，阻礙一抗有效結(jié)合。
與封閉劑/試劑的相互作用：例如，磷酸化蛋白檢測中，脫脂奶粉封閉劑所含的磷酸酶可能降解目標(biāo)表位，而其中的酪蛋白磷酸化背景易導(dǎo)致高噪音——此時(shí)必須選用BSA或無蛋白封閉劑。
如何破局？精準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是關(guān)鍵！
預(yù)判PTM影響：根據(jù)目標(biāo)蛋白特性，針對(duì)性優(yōu)化樣品處理（如磷酸酶抑制劑）、電泳條件、封閉劑及抗體選擇。
驗(yàn)證工具輔助：使用PTM特異性抗體或去修飾處理作為對(duì)照。
