流式數據分析，去粘連了嗎？

流式細胞術作為科研中廣泛應用的單細胞分析技術，數據準確性直接決定實驗結論的可信度。但不少研究者在數據分析時，往往會忽略一個關鍵干擾因素 —— 細胞粘連體。這些由多個細胞粘附形成的異常結構，不僅會導致信號測量失真，還可能堵塞儀器、延長檢測時間，成為實驗結果不可靠的 “隱形殺手”。做好粘連體的識別與排除，是流式數據分析的必備步驟，更是科研數據嚴謹性的基本保障。

粘連體：流式分析的 “隱形干擾源”

粘連體又稱多聚體或黏連體，是檢測過程中兩個及以上細胞因物理或化學作用粘附形成的結構。其危害遠不止信號異常這么簡單：較大的粘連體會堵塞檢測系統，導致液流不穩定，進而減慢樣本獲取速度、延長檢測時間；更關鍵的是，它會破壞單細胞分析的核心前提，使細胞計數、表型分析、周期檢測等結果出現偏差，甚至直接誤導實驗結論的方向。在注重數據可靠性的科研場景中，粘連體的存在相當于給實驗結果埋下了一顆 “定時炸彈”。

粘連體的形成：這些誘因不可忽視

粘連體的產生并非偶然，而是與樣本處理、檢測條件等多個環節密切相關。細胞濃度過高或過度離心會造成機械性聚集；細胞死亡后裂解釋放的粘稠 DNA，會顯著增加細胞間粘附的概率；不當的樣本保存方式，如溫度超過 45℃，會提升樣本黏度進而促進粘連；此外，體系中存在的促進粘連陽離子、樣品通過檢測系統的速度過快，以及儀器液流異常等，都可能誘發或加重這一現象。把控好這些關鍵環節，是減少粘連體產生的基礎防線。

信號原理：辨別粘連體的核心依據

流式信號的本質是細胞通過激光檢測區時產生的脈沖信號，其特征由三個核心參數定義：高度對應最大光信號強度，寬度代表細胞與激光的相互作用時間，面積則是脈沖持續時間內的積分，反映細胞總體光信號強度。單細胞通過激光區時，這三個參數呈現穩定的對應關系；而當細胞粘連形成復合體時，脈沖高度與單細胞差異不大，但由于通過激光區的時間明顯延長，脈沖寬度增加，進而導致脈沖面積顯著上升。這種信號特征的差異，正是識別粘連體的核心原理。

常規去除策略：散射光脈沖信號的應用

流式細胞術的光信號包含前向散射光和側向散射光，二者通常采用線性刻度記錄，是排除粘連體的常用工具。實際操作中，研究者多選擇前向散射光或側向散射光的任意兩個脈沖參數進行組合分析，通過篩選符合單細胞信號特征的群體，實現粘連體的初步去除。但這一方法存在明顯局限 —— 當細胞形態不規則、樣本制備存在異質性，或細胞大小差異顯著時，容易出現誤判。例如在 DNA 含量檢測的細胞周期分析中，大細胞可能因散射光面積值較高，被錯誤歸類為粘連體，影響分析結果。

精準解決方案：DNA 熒光脈沖的優勢場景

針對常規散射光法的局限，DNA 染料測量通道提供了更可靠的選擇。該通道采用線性刻度，能精準反映細胞的 DNA 含量，而粘連體的 DNA 總量顯著高于單細胞，其脈沖信號特征的差異更為明確。在腫瘤細胞系等異質性較強的樣本分析中，這一方法的優勢尤為突出。以 A549 細胞周期分析為例，結合 DNA 熒光脈沖信號與周期蛋白 B1 的表達分析，可有效鑒別 G0/G1 期粘連體。周期蛋白 B1 僅在 G2+M 期表達，缺乏該蛋白免疫熒光且 DNA 熒光信號符合粘連體特征的細胞，可被精準篩選排除，大幅提升檢測準確性。

樣品處理：影響去粘連效果的關鍵變量

不同的樣品處理方式，會直接影響粘連體的去除效率。研究對比了三種常見處理方法：裂解洗滌不固定、裂解不洗滌固定以及無裂解無洗滌。結果顯示，無裂解無洗滌處理時，紅細胞與白細胞易同時通過激光束，導致前向散射光高度與面積參數難以區分單細胞；而裂解處理后的樣本，可通過光散射雙脈沖信號有效篩選單細胞。值得注意的是，無論樣品是否經過裂解或固定，基于 DNA 熒光脈沖信號的方法均能穩定排除粘連體，展現出更強的通用性。這一特性在高濃度樣本或稀有細胞檢測中尤為重要 —— 這類場景中散射光法難以區分單細胞，而 DNA 熒光法可精準鑒別粘連體，同時捕獲更多真實單細胞信號。

流式數據分析的核心是 “真實反映單細胞狀態”，而粘連體的存在會直接打破這一前提。從減少誘因的樣本制備，到基于信號特征的精準鑒別，再到結合樣品類型的方法選擇，去粘連是一個貫穿實驗全程的系統工程。研究者需根據細胞類型、樣本異質性、檢測目的等因素，靈活選擇合適的去粘連策略：常規樣本可采用散射光法，異質性強或周期分析樣本優先選擇 DNA 熒光法，高濃度或特殊處理樣本需結合多種方法驗證。唯有重視并做好粘連體的排除工作，才能確保流式數據的可靠性，為科研結論提供堅實支撐，避免因 “隱形干擾” 導致的實驗資源浪費與結論偏差。