RNA酶活性的控制
為了獲得高質(zhì)量的真核細(xì)胞mRNA, 必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細(xì)胞和滅活RNA酶同步進(jìn)行的方法，最大限度地降低細(xì)胞破碎過(guò)程中所釋放的RNA酶的活性。同時(shí)，避免偶然引入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶法染問(wèn)題的一些注意事項(xiàng)。大多數(shù)有經(jīng)驗(yàn)的研究者并不拘泥于這些注意事項(xiàng)，只是在遇到問(wèn)題時(shí)可能采用其中的一種或幾種方法加以解決。
一、實(shí)驗(yàn)程序
如不謹(jǐn)慎操作，外源性RNA酶可以通過(guò)下述途徑污染RNA制品：
（一）玻璃制品、塑料制品和電泳槽
滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無(wú)RNA酶，可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA.實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿和塑料制品經(jīng)常有RNA酶法染，使用前必須于180℃干烤8小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 %焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑，但其作用并不是絕對(duì)的。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次， 并于100℃干烤15分鐘。在15 lbf/in2（1.034x105Pa）高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC,以防DEPC通過(guò)羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。
羧甲基化的RNA在無(wú)細(xì)胞體系中翻譯效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤堿基均被修飾，否則其形成DNA:RNA或RNA:RNA雜交休的能力并不明顯降低。用于RNA電泳的電泳槽應(yīng)用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3%的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 %DEPC處理過(guò)的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標(biāo)記，存放在指定地點(diǎn)，為RNA實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用。
（二）研究人員造成的污染
RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準(zhǔn)備分離的和分析RNA的材料和溶液時(shí)，主有涉及RNA的一切操作過(guò)程中，都應(yīng)戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)勤換手套。
（三）污染的溶液
用高壓滅菌的水和RNA研究專(zhuān)用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過(guò)的藥匙稱(chēng)取試劑，將溶液裝入無(wú)RNA酶的玻璃器皿。可能的話溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時(shí)，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2（1.034x105Pa）的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。
注：DEPC可與胺類(lèi)迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因些不能用來(lái)處理含有Tris 一類(lèi)的緩沖液。可存幾瓶新的未開(kāi)封的Tris晶體以制備無(wú)RNA酶的溶液。
二、RNA酶的抑制劑
下面介紹3種廣泛應(yīng)用的特異性RNA酶抑制劑。
（一）RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑
RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑是從人胎盤(pán)分離的一種蛋白質(zhì)可與多種RNA酶緊密結(jié)合（KI≈3x1010）形成非共價(jià)結(jié)合的等摩爾復(fù)合物，使RNA酶失活。
此蛋白質(zhì)體內(nèi)可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)與胰RNA酶類(lèi)似的一種血管生成因子， 幾個(gè)廠家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質(zhì)應(yīng)置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50%甘油中，貯存于-20℃。抑制劑制品凍融數(shù)次后或放置在氧化條件下即應(yīng)棄之不用，因?yàn)樯鲜鎏幚頃?huì)使蛋白質(zhì)變性從而釋放出所結(jié)合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動(dòng)物細(xì)胞這一提取RNA的初始步聚中不應(yīng)使用這種蛋白抑制劑。
然而職用更溫和的裂解方法時(shí)應(yīng)使用這種抑制劑，并且在后續(xù)的所有RNA純化步驟中均應(yīng)有此蛋白質(zhì)存在。由于酚抽提可以除蛋白質(zhì)抑制劑，故應(yīng)在純化過(guò)程中補(bǔ)加幾次抑制劑。其最大活性的發(fā)揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無(wú)細(xì)胞體系中的翻譯。
