ATP的生物合成
一、目的
1.了解ATP生物合成的意義。
2.掌握無(wú)機(jī)磷的測(cè)定方法。
3.掌握DEAE-纖維素薄板層析法測(cè)ATP的形成。
二、原理
在適當(dāng)條件下，釀酒酵母分解發(fā)酵液中的葡萄糖，釋出能量，同時(shí)還利用無(wú)機(jī)磷，使AMP轉(zhuǎn)變成ATP，一部分能量即貯存于ATP分子中。因此，在發(fā)酵過(guò)程中，可測(cè)得發(fā)酵液中的無(wú)機(jī)磷含量降低和ATP含量的上升。
三、實(shí)驗(yàn)器材
1.釀酒酵母，新鮮釀酒酵母懸浮于蒸餾水中，離心，棄去上清液。如此用蒸餾水洗滌酵母數(shù)次，最后將洗凈的酵母沉淀冷凍保存①。
2. AMP、 ATP標(biāo)樣
3.燒杯50 或100ml (1)。
4.電子分析天平。
5.水浴鍋。
6.離心機(jī)4000rpm
7.722型（或7220型）分光光度計(jì)。
四、實(shí)驗(yàn)試劑
1.2%三氯醋酸溶液：2g三氯醋酸，溶于100 ml蒸餾水。
2.過(guò)氯酸溶液：0.8 ml過(guò)氯酸，加蒸餾水8.4 ml
3.阿米酚試劑：稱取阿米酚[amidol,二氫氯化-2，4-二氨基苯酚，分子式： （NH4）2C6H3OH?2HCl]2g，與亞硫酸氫鈉（NaHSO3）40g共同研磨，加蒸餾水200ml，過(guò)濾貯棕色瓶?jī)?nèi)備用。
4.鉬酸銨溶液：20.8g(NH4)6Mo7O24%26#8226;4H2O，溶于蒸餾水并稀釋至200ml.
5.1mol/L KOH溶液。
6.1mol/L HCl溶液。
7.ATP溶液：稱取ATP晶體（或粉末）50mg，溶于5.0ml蒸餾水，臨用時(shí)配制。
8.DEAE-纖維素薄板：參看輔助試驗(yàn)。
9.1mol/L NaOH溶液。
10.0.05mol/L pH3.5檸檬酸鈉緩沖液：見輔助試驗(yàn)。
五、操作
1.發(fā)酵
將0.1g KH2PO4及0.58g K2HPO4溶于3ml蒸餾水。
另將0.1g AMP溶于1ml蒸餾水，傾入上述磷酸鉀溶液內(nèi)，加熱至37℃。酵母液5ml，再加4ml蒸餾水稀釋，加熱至37℃，倒入上述溶液中，再加MgCl2 0.016g及葡萄糖0.5g，再加蒸餾水3ml，混勻，立即取樣0.2ml，檢測(cè)AMP及無(wú)機(jī)磷的含量。
此時(shí)測(cè)得的磷稱為初磷。薄板層析圖譜上只有AMP斑點(diǎn)，無(wú)ATP斑點(diǎn)。以后每隔30min取樣測(cè)定，至明顯看出無(wú)機(jī)磷及AMP含量下降、ATP含量上升即可（約2h～3h）。
2發(fā)酵液樣品處理
將所取之0.2ml樣液置離心管中，立即加入2%三氯醋酸溶液1ml，搖勻，離心（3000r/min）10min。上清液用以測(cè)無(wú)機(jī)磷及ATP含量。
3.無(wú)機(jī)磷測(cè)定
吸取上清液0.3ml置于干試管內(nèi)加過(guò)氯酸溶液8.2ml、阿米酚試劑①0.8ml、鉬酸銨溶液0.4ml，混勻，10min后比色測(cè)定A650nm。
本實(shí)驗(yàn)無(wú)需求出無(wú)機(jī)磷的絕對(duì)量，故不作標(biāo)準(zhǔn)曲線。A650nm數(shù)值下降即表示無(wú)機(jī)磷下降。一般情況下，當(dāng)A650nm下降至比初磷A650nm小0.2單位時(shí)，發(fā)酵液中既有較多的ATP。
4.DEAE-纖維素薄板層析法測(cè)ATP的形成：方法見輔助試驗(yàn)，同時(shí)用ATP溶液作對(duì)照。
最好放在低溫冰箱冷凍結(jié)冰。經(jīng)深凍得酵母，發(fā)酵效果好。
阿米酚試劑為還原劑。如用抗壞血酸，效果不好。
輔助試驗(yàn)
一、目的
掌握DEAE―纖維素薄板層析法測(cè)定核苷酸的原理和方法。
二、原理
二乙氨基乙基纖維素，簡(jiǎn)稱DEAE―纖維素，結(jié)構(gòu)式如下：
帶負(fù)電荷的核苷酸離子就被交換上去。控制溶液的pH，使各種核苷酸所帶凈電荷不同，與DEAE―纖維素的親和力也就不同，從而達(dá)到分離的目的。
三、實(shí)驗(yàn)器材
1. 玻璃片4×15cm（×4）。
2. 尼龍布。
3. pH試紙（pH1～14）。
4. 電動(dòng)攪拌器。
5. 水平板。
6. 水平儀。
7. 鉛筆。
8. 紫外分析儀（254nm）。
9. 電吹風(fēng)。
10. 燒杯1 000ml(×1)。
11. 吸濾瓶1 000ml(×1)。
12. 布氏漏斗%26oslash;20cm(×1)。
13. 微量點(diǎn)樣管10%26micro;l(×1)。
四、實(shí)驗(yàn)試劑
1. 核苷酸樣品。
2. DEAE―纖維素（層析用）。
3. 1mol/L NaOH溶液。
4. 1mol/L HCl溶液。
5. 0.05 mol/L檸檬―檸檬鈉緩沖液（pH3.5）：稱取檸檬酸12.20g,檸檬酸鈉6.70g，溶于蒸餾水，稀釋至2 000ml。
五、 操作
1.DEAE―纖維素的處理
先用水洗，抽干后用4倍體積1mol/L NaOH溶液浸泡4h（或攪拌2h），抽干，蒸餾水洗至中性，再用4倍體積1mol/L HCl浸泡2h（或攪拌1h）抽干蒸餾水洗至pH4備用。
2.鋪板：將處理過(guò)的DEAE―纖維素放在燒杯里，加水調(diào)成稀糊狀，攪勻后立即倒在干凈玻璃板上,涂成均勻的薄層，放在水平板上，自然干燥或60℃烘干，備用。
3.點(diǎn)樣：在已烘干的薄板一端2cm處用鉛筆輕劃一基線，用微量點(diǎn)樣管取樣液10%26micro;l②，點(diǎn)在基線上，用冷風(fēng)吹干。
4.展層：在燒杯內(nèi)置pH3.5檸檬酸鈉沖液（液體厚度約1cm）,把點(diǎn)過(guò)樣的薄板傾斜插入此燒杯內(nèi)（點(diǎn)樣端在下），溶劑由下而上流動(dòng)，當(dāng)溶劑前沿到達(dá)距離玻板上端約1cm處（10min左右）取出薄板，用熱風(fēng)吹干，用260nm紫外線照射DEAE―纖維素層觀看斑點(diǎn)。DEAE―纖維素經(jīng)處理可反復(fù)使用。此法具有快速、靈敏的特點(diǎn)
① 如長(zhǎng)期不用，需于60℃以下烘干保存。
② 可用腺三磷粗品或藥用腺三磷結(jié)晶作樣品，樣液核苷酸濃度為每毫升5mg左右時(shí)，點(diǎn)樣量為5～10%26micro;l。可按此標(biāo)準(zhǔn)控制點(diǎn)樣量。
