薄層層析的原理與操作
薄層層析（TLC）技術
薄層色譜，或稱薄層層析 (thin-layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質的特別有效的層析方法，從50年代發展起來至今，仍被廣泛采用。
一、基本原理
薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板(常用玻璃板，也可用滌綸布等)上形成薄層，然后用相應的溶劑進行展開。薄層層析可根據作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析 (離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實驗中應用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。
吸附是表面的一個重要性質。任何兩個相都可以形成表面，吸附就是其中一個相的物質或溶解于其中的溶質在此表面上的密集現象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發生吸附現象。
物質分子 之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子(離子或原子)和固體內部分子所受的吸引力不相等。在固體內部，分子之間相互作用的力是對稱的，其力場互相抵消。而處于固體表面的分子所受的力是不對稱的，向內的一面受到固體內部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩余力的影響，就會被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間內被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內離開此表面的分子之間可以建立動態平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產生平衡與不平衡、吸附與解吸的動態平衡過程。
例如用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數的不同，使混合物得以分離。當溶劑沿著吸附劑移動時，帶著樣品中的各組分一起移動，同時發生連續吸附與解吸作用以及反復分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點。如作為標準的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據這些已知化合物的Rf值(后面介紹Rf值)對各斑點的組分進行鑒定，同時也可以進一步采用某些方法加以定量。
薄層層析有許多優點：它保持了操作方便、設備簡單、顯色容易等特點，同時展開速率快，一般僅需15～20分鐘;混合物易分離，分辨力一般比以往的紙層析高10～100倍，它既適用于只有0.01μg的樣品分離，又能分離大于500mg的樣品作制備用，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點是對生物高分子的分離效果不甚理想。
二、固定相支持劑的選擇和處理
在薄層層析時，對支持劑的選擇主要考慮兩方面：一是支持劑的性質與適用范圍;二是支持劑的顆粒大小。一般來說，所選吸附劑應具有最大的比表面積和足夠的吸附能力，它對欲分離的不同物質應有不同的吸附能力，即有足夠的分辨力;所選吸附劑與溶劑及樣品組分不會發生化學反應。吸附力的強弱規律可概括如下：吸附力與兩相間界面張力的降低成正比，某物質溶液中被吸附的程度與其在溶劑中的溶解度成反比。極性吸附劑易吸附極性物質，非極性吸附劑易吸附非極性物質。同族化合物的吸附程度有一定的變化方向，例如，同系物極性遞減，而被非極性表面吸附的能力將遞增。
1、支持物的性質與適用范圍
薄層層析的支持劑較常用的是硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素、聚酰胺及DEAE—纖維素。
(1)硅膠
硅膠是應用最廣泛的一種極性吸附劑。它的主要優點是化學惰性，具有較大的吸附量，易制備成不同類型、孔徑、表面積的多孔性硅膠，一般以SiO2•xH2O通式表示。硅膠的吸附活性取決于含水量，吸附層析一般采用含水量為10%～12%的硅膠，含水量小于1%的活性最高，而大于20%時，吸附活性最低。用加熱脫水法可使硅膠活化，降低吸附活性的硅膠能顯著改善分離性能，增加樣品的負載量。
硅膠適用于分離酸性和中性物質，堿性物質能與硅膠作用，因此如用中性溶劑展開，堿性物質有時留在原點不動，或者斑點拖尾，而不能很好地分離。為了使某一類化合物得到滿意的分離，可改變硅膠酸堿性。例如，可用稀酸或稀堿液(0.1～0.5mol/L)或一定pH值的緩沖溶液代替水制備酸性、堿性或某一pH值的薄層;也可在硅膠中加入氧化鋁(堿性)制成薄層;或在展開劑中加入少量的酸或堿進行展層。
使用硅膠和硅藻土時，通常要先加入粘合劑再在支持板上涂布。常用的粘合劑為煅石膏和淀粉，在硅膠、氧化鋁和硅藻土中分別加入5%～20%石膏后，稱為硅膠G、氧化鋁G和硅藻土G。用煅石膏為粘合劑的薄層易從玻璃板上脫落，但具有耐腐蝕性試劑的優點。加淀粉制成的薄層，機械性能較好，但不宜用腐蝕性強的試劑。
(2)氧化鋁
氧化鋁為微堿性吸附劑，適用于親脂性物質的分離制備，氧化鋁具有較高的吸附容量，價格低廉，分離效果好，因此應用也較廣泛。在使用氧化鋁作吸附層析時，要注意選擇適當活性及適當酸堿度的產品。氧化鋁通常可按制備方法不同而分為堿性、中性和酸性三種。堿性氧化鋁可應用于碳氫化合物的分離;中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、某些苷類及酸堿溶液中不穩定的酯、內酯等化合物的分離;酸性氧化鋁適用于天然及合成的酸性色素以及醛、酸的分離。
(3)聚酰胺
聚酰胺由己二酸與己二胺聚合而成，也可用己內酰胺聚合而成，因它們都含有大量酰胺基團，故統稱聚酰胺。
聚酰胺薄膜層析是1966年后發展起來的一種薄層層析方法，用此方法分析氨基酸衍生物DNP-氨基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸及DABTH-氨基酸時，具有靈敏度高、分辨力強、展層迅速和操作簡便等優點。目前由國產原料制成的聚酰胺薄膜性能良好、效果滿意，已用于酚類、醌類、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸堿基、核苷、核苷酸、雜環化合物、合成染料;磺胺、抗菌素、環酮、殺蟲劑及維生素B等16類化合物的分析。
(4)硅藻土和纖維素
它們是中性支持劑，需在吸附水、緩沖溶液或甲酰胺等之后，才能用于薄層層析。
2、支持劑的顆粒大小
用作薄層層析固定相的支持劑顆粒，要求大小適當、均勻。顆粒過大，展開時溶劑推進速率太快，分離效果不好;顆粒太小，展開太慢，斑點拖尾不集中，分離效果也差。顆粒大小固定在一定范圍內并且薄層厚度均勻一致時，每次得出的Rf值即可保持恒定。無機類支持劑的顆粒以150～200目(直徑為0.07～0.1mm)、薄層厚度為0.25～1mm較合適。有機吸附劑如纖維素等的顆粒為70～140目(直徑0.1～0.2mm)、薄層厚度為1～2mm最恰當。
三、薄層板制作
薄層板制作簡稱制板，是指作為固定相的支持劑被均勻地涂布在玻板上，形成一薄層。所用的玻板要求表面平滑、清潔。玻板的大小按需要選定，常用的規格為6cm×20cm、20cm×20cm及2.5cm×7.5cm。
1、軟板制作
軟板也稱干板，是不加粘合劑，將支持劑干粉直接均勻地鋪在玻板上制成的。這種薄層板制作簡單，展開快，但極易吹散。其具體制作方法如下：
(1)選用直徑約為0.5cm的玻璃管一根，根據薄層的厚度(一般為0.4～1mm)在其兩端繞膠布數圈。
(2)將支持物干粉倒在玻板上，固定玻板一端以防玻璃推進時移動。
(3)將玻璃管壓在玻板上，將支持劑干粉由一端推向另一端即成薄層。
2、硬板制作
硬板或稱濕板，是將支持劑加粘合劑和水或其他液體后，均勻地鋪在玻璃板上，再經烘干而成的薄層板。制作方法可用專門的薄層制板器，也可用手工，均能得到滿意的效果。下面介紹三種手工涂布制板的方法：
(1)玻棒涂布
將支持劑用水或適當溶劑調成膠漿，倒在玻板上，然后依軟板制作相同方法，用玻棒在玻板上將支持劑由一端向另一端推動，即成薄層。
(2)玻片涂布
在玻板兩旁放置兩塊稍厚的玻板，把支持劑膠漿倒在中間的玻板上，然后用另一塊玻片的邊緣將膠漿刮向另一端，即成一定厚度的薄層。干燥后用刀刮去薄板兩側的支持劑。更換玻板兩旁不同厚度的玻片，即可調節薄層的厚度。
(3)傾斜涂布
將支持劑膠漿倒在玻片上，然后將玻板傾斜，使膠漿均勻涂布于玻板上。
上述任何一種方法將支持劑均勻涂布于玻板上后，靜置片刻，待薄層表面無水漬后，置烘箱中，讓溫度升到100℃，持續1小時。關閉電源，待溫度降至接近室溫時，取出薄層板，放入干燥器備用。此一步驟稱為活化。
四、點樣
點樣是將經處理后的樣品點加在薄層的特定部位，這是一項需要十分仔細的操作步驟，點樣的好壞會直接影響分離效果。點樣可用玻璃毛細管，如作定量測定，應使用微量移液管或微量注射器，市售血球計數管經加工磨尖頭部并標定體積后使用也甚理想。點樣的位置，上行展開法一般點樣在離薄層下端4～5cm處，下行展開法在離上端6～8cm處。如作雙相紙層析分離，點樣處應位于距薄層右側邊5cm與距底邊5cm直線的交點。
薄層層析點樣方法應注意以下幾點：
(1)樣品最好用具揮發性的有機溶劑(如乙醇、氯仿等)溶解，不應用水溶液，因水分子與吸附劑的相互作用力較弱，當它占據了吸附劑表面上的活性位置時，就使吸附劑的活性降低，而使斑點擴散。
(2)點樣量不宜太多，否則會降低Rf值，一般為幾到幾十μg，體積為1～20μg。
(3)原點直徑要控制在2mm以內。欲達此目的，就須分次點樣，邊點樣，邊用冷、熱風交替吹干。
(4)薄層板在空氣中不能放置太久，否則會因吸潮降低活性。
五、展層
1、展開劑的選擇
選擇展開劑須視被分離物的極性及支持劑的性質而定。對初選展開劑合適與否的評價，要根據其分離有效成分的效果來確定。如果不合適，還需進行極性調整，直到達到對有效成分的完全分離為止。
如果薄層層析所用的支持劑是吸附劑，在同一吸附劑上，不同化合物的吸附性質有如下規律：
①飽和碳氫化合物不易被吸附;
②不飽和碳氫化合物易被吸附，分子中雙鍵愈多，則吸附得愈緊密;
③當碳氫化合物被一個功能基取代后，吸附性增大。吸附性較大的化合物，一般需用極性較大的溶劑才能推動它。
選擇展開劑的另一個依據是溶劑的極性大小。一般而論，在同一種支持劑上，凡溶劑的極性愈大，則對同一性質的化合物的洗脫能力也愈大，即在薄層上能把此化合物推進得愈遠，Rf值也愈大。如果用一種溶劑去展開某一成分，當發現它的Rf值太小時，可考慮換用一種極性較大的溶劑，或在原來的溶劑中加入一定量極性較大的溶劑進行層析。溶劑極性大小的次序是：
石油醚<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<乙酸甲酯<丙酮<正丙醇<甲醇<水。
2、展層
展層裝置種類較多，根據展層方式基本上可分上行、下行、連續及水平式四種。不加粘合劑的薄層只能作近水平式(板與水平成10度～20度角)的上行或下行展開。不論何種展層方式，展層容器必須關閉，并事先要使展開劑蒸氣達到飽和。容器的體積大小要視薄層板的面積而定，因為大容器要達到溶劑蒸氣飽和所需的時間比小的長。根據實驗證明，在不飽和的展層裝置中，由于混合展開劑內含有幾種揮發性試劑，致使薄層板邊緣與中間的試劑比例不同，因此樣品在邊緣和中間展層的距離也不同，這種現象稱為邊緣效應，嚴重時會影響分離效果。
薄層層析時為了獲得更好的分離效果，可采用雙向展層和分次展層。分次展層是先用一種溶劑展開至一定距離后，將薄層板取出，待溶劑揮發后再按同一方向用第二種溶劑展開。
六、顯色和定量
薄層板展開完成后，從展開裝置中取出，于室溫或烘箱中干燥，然后根據被分離物質的種類和性質，選用相應的顯色劑噴霧顯色，或用紫外燈檢測被分離的物質斑點，測量和計算各斑點的Rf值。通過薄層層析被分離的各種溶質組分在濾紙上移動的速率通常用Rf表示：Rf=組分移動的距離/溶劑前沿移動的距離=原點至組分斑點中心的距離/原點至溶劑前沿的距離。
在薄層、溶劑、溫度等各項實驗條件恒定的情況下，各物質的Rf值是不變的，它不隨溶劑移動距離的改變而變化。Rf與分配系數K的關系：
Rf=1/(1+αK)
α是由薄層性質決定的一個常數。由此可見，K值愈大，溶質分配于固定相的趨勢愈大，而Rf值愈小;反之，K值愈小，則分配于流動相的趨勢愈大，Rf值是定性分析的重要指標。
在樣品所含溶質較多或某些組分在單相薄層層析中的Rf比較接近，不易明顯分離時，可采用雙相薄層層析法。該法是將濾紙在某一特殊的溶劑系統中按一個方向展層以后，即予以干燥，再轉向90度，在另一溶劑系統中進行展層，待溶劑到達所要求的距離后，取出薄層，干燥顯色，從而獲得雙相層析譜。應用這種方法，如果溶質在第一種溶劑中不能完全分開，而經過第二種溶劑的層析能得以完全分開，大大地提高了分離效果。
由于薄層層析在分析定量時需注意以下幾點：
(1)在噴霧顯色時，不加粘合劑的薄層要小心操作，以免吹散吸附劑。
(2)薄層層析還可以用強腐蝕性顯色劑，如硫酸、硝酸、鉻酸或其他混合溶液。這些顯色劑幾乎可以使所有的有機化合物轉變為碳，如果支持劑是無機吸附劑，薄層板經此類顯色劑噴霧后，被分離的有機物斑點即顯示黑色。此類顯色劑不適用于定量測定或制備用的薄層上。
(3)如果樣品斑點本身在紫外光下不顯熒光，可采用熒光薄層檢測法，即在吸附劑中加入熒光物質，或在制備好的薄層上噴霧熒光物質，制成熒光薄層。這樣在紫外光下薄層本身顯示熒光，而樣品斑點不顯熒光。吸附劑中加入的熒光物質常用的有1.5%硅酸鋅鎘粉，或在薄層上噴霧0.04%熒光素鈉、0.5%硫酸奎寧醇溶液或1%磺基水楊酸的丙酮溶液。
(4)由于薄層邊緣含水量不一致，薄層的厚度、溶劑展開距離的增大，均會影響Rf值，因此在鑒定樣品的某一成分時，應用已知標準樣作對照。
(5)定量時，可對斑點作光密度測定，也可將一個斑點顯色，而將與其相同Rf值的另一未顯色斑點從薄層板上連同吸附劑一起刮下，然后用適當的溶劑將被分離的物質從吸附劑上洗脫下來，進行定量測定。
七、薄層層析法的近代發展
薄層層析法由于其本身所具有的許多優點，幾十年來，在混合物的分離、定性及定量分析中的應用相當普遍，并逐漸取代了紙層析分離技術。為了克服薄層層析法存在的某些不足，獲得更有效的分離效果，在薄層制備、展開方式、分析鑒定手段以及相配套的儀器設備等方面近年來進行了許多革新，其中最根本的是支持劑的改進。以一種直徑更小的支持劑顆粒替代常規的支持劑劑型所制備的薄層，比常規的薄層具有所需樣品少、展開速率快、距離短、分辨力高等優點;而且此種新型的薄層具有較好的光學特性，更有利于對分離斑點進行光密度掃描。為了區別于常規的薄層層析分析法，通常將此種新方法稱為高效薄層層析法(high performance thin-layer chromatography，HPTLC)，也稱現代薄層層析法(modern TLC)。
在進行HPTLC時，為了保證恒定的吸附劑活性和薄層板的相對濕度，預制板可用固定相浸漬劑加以處理。經處理后的薄層板一般不再受外界濕度的影響。固定相浸漬劑分兩類：
①親水性固定相，多數用甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙二醇和不同相對分子質量的聚乙二醇或不同種類的鹽溶液浸漬;
②親脂性固定相，一般作反向層析用，多數用液體石蠟、十一烷、十四烷、礦物油、硅酮油或乙基油酸鹽等浸漬。也有利用與浸漬劑形成絡合物或加成物得以分離的，如經三硝基苯或苦味酸浸漬的，可利用絡合反應分離多環化合物。用NaHSO2浸漬，可與含有羰基化合物生成加成物而得以分離。
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