破骨細胞的分離培養
簡介
作為高度分化的多核巨細胞，破骨細胞主要來源于單核/巨噬細胞造血干細胞系，是一種具有骨吸收功能的細胞，目前研究破骨細胞分化的經典細胞系包括小鼠 RAW264.7 單核巨噬細胞系與小鼠原代 BMMs 細胞系。
其中 RAW264.7 細胞是 Abelson 鼠白血病病毒誘導 BALB/c 小鼠腫瘤生成后，收集小鼠腹水中單核樣巨噬細胞得到的細胞株，被廣泛應用于細胞生物學和免疫學研究中。RAW264.7 細胞突破了原代單核巨噬細胞不能增殖傳代的限制，并且通過 RANKL 誘導獲得的 RAW-OCs 骨吸收能力與 RANKL 誘導 BMMs 分化形成的破骨細胞相似。
BMMs 屬于原代細胞，在體外培養過程需要額外添加 M-CSF 維持其存活，并且BMMs 不能傳代，但 BMMs 能夠更好的模擬人體內破骨細胞的分化及骨分解功能。
原理
破骨細胞是分化后的終末細胞，沒有增殖分裂的能力，在體內是單核巨噬細胞 BMMs 分化而來的。BMMs 細胞表面表達 c-fms 和 RANK 受體，在細胞因子 M-CSF 和 RANKL 的作用下，單核巨噬細胞能夠增殖并啟動分化。因此在體外培養破骨細胞 RANKL 和 M-CSF 兩種細胞因子缺一不可，應先提取 BMMs 并在培養基里添加 M-CSF 和 RANKL 從而啟動細胞分化，獲得破骨細胞。
用途
用以模擬體內破骨細胞分化過程，獲得破骨細胞后對藥物進行篩選，探索分化前后細胞通路、基因水平、蛋白水平的變化情況。
圖源自：S. L. Teitelbaum, Science 2000, 289, 1504~1508.
材料與儀器
C57BL/6 小鼠（常用 4~8 周齡，雄性小鼠），alpha-MEM 培養基，雙抗
胎牛血清，手術器械，二氧化碳，培養皿，超凈臺，M-CSF 細胞因子
RANKL 細胞因子、TRAP 染液等
步驟
1. 使用二氧化碳窒息法將小鼠處死，并泡在 75% 乙醇中消毒 10 min。
2. 在動物房超凈臺中將小鼠下肢的股骨與脛骨剝離，浸泡在 PBS 中。
3. 在細胞房超凈臺中，將股骨或脛骨兩端剪開，刮凈骨外膜及其他附著組織，用 1 mL 注射器吸取 Alpha-MEM，輕輕的將針頭插進骨的一端，輕柔的沖洗骨髓腔，反復三次直到骨髓腔變白并收集沖下來的培養基。
4. 室溫下 1000 rpm 離心 15 min，棄上清液，使用 Alpha-MEM 完全培養基（10% 胎牛血清+雙抗）重懸細胞沉淀，并鋪在兩個 10 cm 細胞培養皿中，細胞放進細胞培養箱中培養 12~24 小時。
5. 第二天棄除細胞上清液和不貼壁的細胞，使用 1000 μL 移液槍吸取 Alpha-MEM 完全培養基輕輕的反復吹打細胞培養皿底，將半貼壁細胞吹下并收集細胞懸液。
6. 室溫下使用離心機 1000 rpm 離心 5 min，棄除上清液，收集細胞沉淀，使用 Alpha-MEM 完全培養基（添加 30 ng/mL M-CSF）重懸細胞，并將其進行鋪板（以 96 孔板為例），每孔鋪 8000 細胞，放進細胞培養箱中培養 12~24 小時，直至多數細胞貼壁。
7. 將 96 孔板中原培養基移除，更換新鮮配置的 Alpha-MEM 完全培養基（30 ng/mL M-CSF 和 30 ng/mL RANKL），放回細胞培養箱中，每 48 小時換液一次，每次換液培養基中均需要新鮮配置額外添加 M-CSF 與 RANKL 的 Alpha-MEM 完全培養基。
8. 約 3 天后，可在光鏡下發現出現多核細胞，5~6天 后在顯微鏡下可以觀察到出現了大量具有明顯褶皺邊緣，多核的「巨大」細胞，使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法對破骨細胞特異表達的 TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）進行染色，被染色成紫紅色，且多核的細胞即為分化成功的破骨細胞。
注意事項
提取骨髓內細胞時動作必須輕柔。在提取當天培養細胞時可以添加 M-CSF 也可以不添加。M-CSF 和 RANKL 細胞因子要盡量選擇質量好的試劑公司提供的產品，并保存在 -80 °C。
常見問題
1. 提取細胞后第二天細胞培養液出現渾濁并非污染，而是紅細胞不貼壁導致的，只需要將上清液和不貼壁的細胞移除即可，但動作要輕，不然半貼壁的 BMMs 也會有損失。
2. 破骨細胞一般在添加 RANKL 后的第 5~6 天大量出現，此時就應該對細胞進行 TRAP 染色并鑒定，7~8 天之后，破骨細胞會大量死亡。
參考來源：
1. Boyle, W.J., Simonet, W.S. & Lacey, D.L. Osteoclast differentiation and activation[J]. Nature, 2003; 423：337~342.
2. Teitelbaum, S.L. Bone resorption by osteoclasts[J]. Science,2000;289：1504~1508.
