細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實驗（CETSA）

原理

CETSA（Cellular Thermal Shift Assay，細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實驗）是一種檢測細(xì)胞內(nèi)藥物與靶蛋白結(jié)合效率的實驗，其原理是靶蛋白與藥物分子結(jié)合時通常會變得穩(wěn)定。

隨著溫度的升高，蛋白會發(fā)生降解；當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)合藥物后，相同溫度下，未降解蛋白的量會提高，該復(fù)合蛋白的熱熔曲線會右移。其樣品來源可以是細(xì)胞，也可以是組織，檢測方法主要有免疫印跡（Western blotting）和蛋白質(zhì)譜（MS）。

用途

直接監(jiān)測完整細(xì)胞和組織樣品中蛋白質(zhì)相互作用狀態(tài)的功能調(diào)節(jié)，也可用于驗證某一藥物與靶蛋白的結(jié)合關(guān)系。

材料與儀器

HEK 293T 細(xì)胞、PBS、DMSO、PCR 管

液氮等

步驟

1、將構(gòu)建好的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到 HEK 293T 細(xì)胞中進行體內(nèi)細(xì)胞熱移實驗 (CETSA)。

2、按照制造商的方案轉(zhuǎn)染 HEK 293T 細(xì)胞 8 小時，隨后將細(xì)胞暴露于 DMSO 或者 elaiophylin 中 24 小時，收集細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑 （1 mmol/L PMSF 或者 50×cocktail） 的 PBS 洗滌。對照細(xì)胞用相同體積的 PBS 孵育。

3、細(xì)胞培養(yǎng)計數(shù)后，用 PBS（含 1 mmol/L PMSF 或者 50×cocktail） 重懸至最終密度 2×107/ml。

4、然后將細(xì)胞分裝于 7 根 PCR 管中，并在指定溫度（37℃~67℃ 梯度）下在熱循環(huán)器 (Bio-Rad, T100) 中加熱 3 分鐘以使蛋白質(zhì)變性。

5、然后將細(xì)胞重懸于 NP40 緩沖液中，用液氮進行 3 次凍融循環(huán)。

6、4 ℃，20, 000×g 離心 20 min，收集上清。

7、往上清液中加等量的 2×SDS loading buffer，沸水滅活 10 min，取 20 μl，用 SDS-PAGE 凝膠進行 Western blotting（如果需要可切膠送公司做質(zhì)譜分析）。

8、使用 GraphPad Prism 軟件進行 CETSA 曲線分析，并進行達(dá)到 50% 溫度 (Tm50) 值的熱穩(wěn)定性分析。

注意事項

第 6 步的離心需要在 4 ℃ 離心機中完成。

常見問題

在傳統(tǒng) Western blotting 操作過程中受跑膠，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育，顯影等人工操作的影響，重復(fù)性會相對較差。建議先取少量樣品跑一次預(yù)實驗。