染色質(zhì)免疫共沉淀測序（chip-seq）

簡介

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前唯一研究體內(nèi) DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的方法，主要包括 ChIP-qPCR 和 ChIP-seq 兩種。利用 ChIP-seq 技術(shù)能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子等互作的 DNA 區(qū)段。

原理

真核生物的基因組 DNA 以染色質(zhì)的形式存在。使用甲醛將目的蛋白和 DNA 交聯(lián)固定，并通過超聲處理或核酸酶消化使染色質(zhì)碎裂；再利用抗體特異性沉淀分離組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子等及其結(jié)合的染色質(zhì)，即染色質(zhì)免疫共沉淀產(chǎn)物；通過蛋白酶解交聯(lián)，使目的蛋白與 DNA 分開，純化 DNA 后通過下一代測序 (NGS) 技術(shù)檢測和定量富集的 DNA 片段。

用途

用于分析與目的蛋白（轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白）相互作用的 DNA 片段。

材料與儀器

甲醛、甘氨酸、預冷的 PBS、ChIP 裂解緩沖液、洗脫緩沖液、氯化鈉、RNase、蛋白酶 K、Tris-EDTA (TE)、100 bp DNA marker、 1.5% 瓊脂糖凝膠、RIPA 緩沖液、一抗、Protein A/G 磁珠、低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液、氯化鋰洗滌緩沖液。

步驟

1.DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)和收集細胞

用甲醛交聯(lián)蛋白質(zhì)和 DNA。交聯(lián)程序與時間有關(guān)，需要優(yōu)化。

提示：樣本的建議交聯(lián)時間為 2~30 分鐘，過度交聯(lián)會降低抗原的可及性及超聲效果，表位也可能被掩蓋。加入甘氨酸封閉甲醛，終止交聯(lián)反應(yīng)。

1.1 首先，準備 2×107~1×108 個細胞。直接向培養(yǎng)基中逐滴滴加甲醛，至終濃度為 0.75%，然后在室溫下輕柔旋轉(zhuǎn) 10 分鐘，促使蛋白質(zhì)與 DNA 交聯(lián)。

1.2 向培養(yǎng)基中添加甘氨酸，至終濃度為 125 mM，室溫下振蕩孵育 5 分鐘。

1.3 用 10 mL 冰的 PBS 沖洗細胞 2 次。

1.4 加入 5 mL 冰的 PBS，刮下細胞，移入離心管中。

1.5 4 ℃，1 000 g 離心 5 分鐘。

1.6 小心吸取上清液，將沉淀重懸于 ChIP 裂解緩沖液中（每 107 個細胞加 750 μL），置于冰上孵育 10 分鐘。

2. 對細胞裂解液進行超聲處理，以分離染色質(zhì)

2.1 對裂解液進行超聲處理以剪切 DNA，并確保 DNA 的平均片段大小為 200~1 000 bp。超聲處理時間需要優(yōu)化。

2.2 超聲處理完成后，4 ℃，8 000 g 離心 10 分鐘，取上清液至新管中。

3. 計算 DNA 濃度，并測定 DNA 片段大小

經(jīng)過超聲處理的染色質(zhì)樣本可用于計算后續(xù) IP 的 DNA 濃度，并電泳檢測 DNA 片段大小。

3.1 取 50 μL 經(jīng)超聲處理的樣本，測定 DNA 濃度和片段大小。

3.2 向 50 μL 染色質(zhì)中加入 70 μL 洗脫緩沖液。

3.3 加入 4.8 μL 5 M NaCl 和 2 μL RNase A（10 mg/mL），65 ℃ 下振搖孵育過夜。

3.4 加入 2 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL），60 ℃ 下振搖孵育 1 小時。

3.5 使用 PCR 純化試劑盒或苯酚：氯仿萃取法純化 DNA。

3.6 為測定 DNA 濃度，取 5 μL 純化 DNA，轉(zhuǎn)移至含 995 μL TE 的試管中，稀釋 200 倍，并讀取 OD260。DNA 濃度 (μg/mL) 為 OD260×10 000。用于計算制備染色質(zhì)的 DNA 濃度。在帶 100 bp DNA marker 的 1.5% 瓊脂糖凝膠中電泳純化 DNA，以測定片段大小。

4. 染色質(zhì)免疫沉淀（IP）

4.1 使用步驟 2.2 制備的染色質(zhì)。建議每次 IP 使用約 25 μg DNA。按 1:10 的比例用 RIPA 緩沖液稀釋每個樣本。設(shè)置一個 IgG 抗體對照和一個僅加磁珠的對照。取 50 μL 染色質(zhì)作為 input 樣本，-20 ℃ 下保存?zhèn)溆谩?/span>

4.2 在所有樣本（僅加磁珠的對照除外）中加入一抗，并在 4 度下旋轉(zhuǎn)孵育 1 小時。抗體用量應(yīng)事先通過實驗確定；一般來說，每 25 μg DNA 加入 1~10 μg 抗體（最佳抗體是經(jīng) ChIP 驗證的抗體，IP 驗證次之，抗體量參考廠家推薦）。

4.3 制備蛋白 A/G 磁珠（按照實驗選擇適合磁珠）

4.4 在所有樣本中加入 60 μL 蛋白 A/G 磁珠，4 ℃ 下旋轉(zhuǎn)過夜。

4.5 2 000 g 離心 1 分鐘，除去上清液。

4.6 按照以下步驟進行洗滌：分別在低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液和氯化鋰洗滌緩沖液中洗滌一次。每次洗滌后，2 000 g 離心 1 分鐘，除去上清液。

5. 洗脫并解交聯(lián)

5.1 在蛋白 A/G 磁珠中加入 120 μL 洗脫緩沖液，以洗脫 DNA，30 ℃ 下緩慢渦旋 15 分鐘。

5.2 2000 g 離心 1 分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。

5.3 加入 4.8 μL 5 M NaCl 和 2 μL RNase A（10 mg/mL），65 ℃ 下振搖孵育過夜。

5.4 加入 2 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL），60 ℃ 下振搖孵育 1 小時。

5.5 DNA 可使用 PCR 純化試劑盒或苯酚-氯仿萃取法進行純化。

6. ChIP-seq 分析 DNA 水平

使用 ChIP-seq 方法時，通過測序進行 DNA 水平分析。使用該方案產(chǎn)生的 DNA 適合用作制備測序文庫的 input。

注意事項

1. 蛋白 A 和 G 磁珠對各種屬不同免疫球蛋白同種型的親和力不同，根據(jù)使用的 IP 抗體選用。

2. 如果觀察到高背景，可能需要增加洗滌步驟。也可以在步驟 4.2 之前，預先用蛋白 A/G 磁珠孵育 1 小時，去除與磁珠發(fā)生的非特異性結(jié)合。將上清液（經(jīng)過超聲處理的染色質(zhì)）轉(zhuǎn)移至一個新管中，然后按照步驟 4.2 對抗體和磁珠進行孵育。

常見問題

1. 為什么使用RNase A？

使用 PCR 純化試劑盒時，高水平的 RNA 會干擾 DNA 純化，因此需要使用 RNase A 處理樣本。否則純化柱吸附飽和時產(chǎn)物會大大減少。

2. 為什么使用蛋白酶 K？

用蛋白酶 K 處理樣本，可使鄰近脂肪與芳香族氨基酸羧基的肽鍵斷裂。從而破壞蛋白質(zhì)和 DNA 之間的交聯(lián)，促進 DNA 的純化。

3. 染色質(zhì)消化片段過大（>1 000 bp）或過小（<150 bp）。

過度交聯(lián)。交聯(lián)超過 10 分鐘可能會抑制染色質(zhì)的消化。

添加至染色質(zhì)消化的細胞不足。

不同細胞系所需的超聲處理時間不同。

4. 陰性對照 IgG-IP 和實驗組抗體 IP PCR 反應(yīng)中產(chǎn)物的數(shù)量相等。

添加至 IP 反應(yīng)的染色質(zhì)過多或不足。或者，添加至 IP 反應(yīng)的抗體過多。

5. 實驗組抗體 IP PCR 反應(yīng)中無產(chǎn)物。

添加至 PCR 反應(yīng)的 DNA 不足。

添加至 IP 反應(yīng)的抗體不足。

抗體不適用于 IP。