蛋白過鎳柱純化

簡介

在重組蛋白表達純化的過程中 His-Tag 是最為常見的標簽，對于大多數蛋白（可溶或包涵體）都可以使用該方法進行初步的純化。

原理

Ni2+ 能夠螯合配體填充并固定在層析介質上，組氨酸（His）帶有一個咪唑基團，該基團能夠與 Ni2+ 形成配位鍵并選擇性結合，而不帶有 His 殘基的蛋白不能與 Ni2+ 形成配位鍵并結合，這樣便能有效地將目的蛋白（具有 His-Tag 的蛋白）與非目的蛋白進行有效區分。

隨后通過高濃度的咪唑緩沖液與 His-Tag 競爭結合 Ni2+，將目的蛋白洗脫并進行收集，從而得到較為純凈的目的蛋白。

用途

純化帶有 His 標記的目的蛋白。

材料與儀器

Ni2+ 親和柱、0.2 M NiSO4 溶液

100 mM EDTA 溶液、0.2 M NaOH 溶液

ddH2O、0.22 μm 濾膜

結合緩沖液：低濃度咪唑緩沖液

洗脫緩沖液：高濃度咪唑緩沖液等

步驟

1、Ni2+ 親和柱的重生

1）將 Ni2+ 親和柱接在泵頭上，使用 ddH2O 沖洗 5 個柱體積。

2）隨后更換為 EDTA 溶液沖洗 5 個柱體積，使用 ddH2O 沖洗 5 個柱體積。

3）使用 0.2 M NaOH 溶液沖洗 5 個柱體積，使用 ddH2O 沖洗 10 個柱體積。

4）使用 NiSO4 溶液填充親和柱，沖洗 5 個柱體積，使用 ddH2O 沖洗 5 個柱體積。

以上 Ni2+ 親和柱重生完畢。

2、Ni2+ 親和柱的平衡

將 Ni2+ 親和柱接在泵頭上，使用低濃度咪唑鹽緩沖液沖洗 5 個柱體積。

3、帶有 His-Tag 的目的蛋白與 Ni2+ 親和柱結合

1）將表達蛋白的菌液放入高速離心機離心，5000 rpm、4 °C、10 分鐘，收集菌塊，-20 ℃ 或 -80 ℃ 凍存備用。

2）使用低濃度咪唑緩沖液將菌塊重懸。

3）在冰浴條件下，使用壓力破碎儀或超聲破碎儀釋放表達的蛋白，超聲破碎儀不盡相同需優化實驗條件。若超聲后菌液依然渾濁，需適當增加功率，延長超聲時間。

4）將懸液置于超高速離心機中，4 °C，18000 rpm，25 分鐘，分離上層蛋白清液和沉淀。

5）SDS-PAGE 電泳檢測：確定蛋白是可溶性（上清）表達還是包涵體（沉淀）表達。

6）Ni2+ 親和柱接在泵頭上，在 4 °C 條件下將蛋白裂解液慢速恒速通過Ni2+ 親和柱。

7）使用低濃度咪唑緩（10 mM 咪唑）沖液 2~5 mL/min 流過 Ni2+ 親和柱，約 5 個柱體積。

8）用分別含 50、100、200、300、400 mM 咪唑緩沖液進行階段洗脫，流速為 2~5 mL/min，收集各階段洗脫峰，每個濃度咪唑緩沖液流過 2 個柱體積。

9）收集得到蛋白樣品用 SDS-PAGE 檢測融合蛋白的分子量大小和純度。

10）用 ddH2O 沖洗 Ni2+ 親和柱 5 個柱體積，再用 20% 的乙醇沖洗 Ni2+ 親和柱 3 個柱體積，流速為 2~5 mL/min，柱子始終置于低溫環境中保存。

11）對 SDS-PAGE 檢測得到的高純度蛋白進行濃縮，并在短時間內進行緩沖液置換和下一步純化實驗。

注意事項

1. 在設計重組蛋白時通常建議在 C 端或 N 端添加 6 個 His-Tag 標簽，確保表達質粒構建成功且 IPTG 誘導重組菌表達的濃度合適，設計預實驗判定后進行正式實驗。

2. His-Tag 的分子量非常小，幾乎不會影響目的蛋白的高級結構。

3. His-Tag 往往被設計在 N 端，這樣與細菌的轉錄機制能夠更好的兼容。

4. 如果實驗室條件較好，可以應用 ?KTATM 系統進行蛋白的自動純化。

5. 所用到的緩沖液都應該過 0.22 μm 濾膜。

6. 蛋白在高濃度咪唑鹽中保存往往會變形，應該盡快進行下一步實驗或進行緩沖液置換。

7. 緩沖液配方多樣，常用 pH 7.4 的 PBS 溶液加不同濃度的咪唑鹽。

8. 實驗室沒有超高速離心機，可以使用 0.45 μm 濾膜過濾壓力破菌儀或超聲破菌儀釋放表達的蛋白懸液。

9. 柱子長時間不用應將內部的 Ni2+ 洗脫干凈，并使用 20% 乙醇溶液進行冷藏保存，防止微生物生長。

10. 每次填充的 Ni2+ 親和柱使用三次后應當再次重生，以提高純化效率。

11. 需設計預確定蛋白是可溶性（上清）表達還是包涵體（沉淀）表達。

常見問題

1.蛋白不掛柱

1）首先判斷目的蛋白是否具有良好的水溶性，如果目的蛋白水溶性較差，建議添加 MBP 標簽增加蛋白的水溶性。

2）可能在裂菌的過程中蛋白沒有完全釋放，可以增大壓力、超聲的功率或者破菌時間以及添加適量的溶菌酶。

3）上層蛋白清液應用較慢的流速恒流通過 Ni2+ 親和柱，可以循環掛柱 2~3 次。

4）His-Tag 沒有完全暴露，可以在裂菌過程中添加 1% 甘油或 2~5 mM DTT/β-巰基乙醇，使得 His-Tag 充分暴露。

2. 目的蛋白洗脫不下來

提高洗脫液中 Ni2+ 的濃度，或增加 NaCl 和非離子去污劑的濃度。注意高濃度 NaCl 可能會引起蛋白質的變性。

3. 在 SDS-PAGE 檢測過程中發現雜蛋白條帶較多

1）提高低濃度咪唑緩沖液的咪唑濃度。

2）使用多標簽多步純化，例如添加 MBP-Tag 標簽即可使用 MBP 親和柱進行進一步純化。或根據蛋白的等電點，利用 HP/Q 柱進行純化，最后可以通過蛋白的分子量大小利用 SEC 柱進行蛋白分子量區分。

4. 在沖洗過程中柱子進空氣了

將柱子倒掛在泵頭上，使用較快流速沖洗結合緩沖液或 ddH2O 10~20 個柱體積，將氣體全部排空。