芽孢桿菌表達系統

簡介

蛋白質表達技術是將克隆化基因插入合適載體后導入宿主細胞用于表達蛋白質的方法，按照宿主細胞來劃分，蛋白質表達系統可以分為原核表達系統和真核表達系統兩大類。

原核表達系統有大腸桿菌表達系統、芽孢桿菌表達系統、鏈霉菌表達系統等，真核表達系統有酵母菌表達系統、昆蟲表達系統、哺乳動物表達系統和植物細胞表達系統。

其中芽孢桿菌表達系統作為基因工程表達系統，因具有外源蛋白易分離純化、表達的外源蛋白不會形成包涵體、無致病性等多種優勢而被廣泛的研究和應用。

原理

芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌和重要的原核表達宿主，細胞只有一層膜結構，分泌系統完善，可以直接將許多蛋白分泌到培養基中，表達的蛋白質產物不易形成包涵體，無需細胞破碎，無胞內蛋白污染，有利于后續分離純化。

用途

用于酶制劑、多肽類藥物等多種外源蛋白的分泌表達。

材料與儀器

大腸桿菌 DH5α、LB 培養基、2 mL EP 管、質粒提取試劑盒、芽孢桿菌相對應的培養基

步驟

1. 將目的基因連接到穿梭的表達載體上，載體中通常包含啟動子、選擇性標志基因和表達縮短型的蛋白質所需要用到的基因信息，轉化到大腸桿菌 DH5α感受態中，涂在含相應抗性的 LB 平板上，37 ℃ 過夜培養。

2. 篩選陽性轉化子，轉入 LB 液體培養基中，37 ℃，200 rpm/min 培養 12~16 h，取 2~4 mL 菌液于 2 mL 的 EP 管中，按質粒提取試劑盒說明書提取質粒。

3. 將凍存于 -80 ℃ 的芽孢桿菌菌液在 LB 平板上劃線，放置于 37 ℃ 恒溫培養箱中，過夜培養 12~16 h，挑取單菌落接種于對應的液體培養基中，制作芽孢桿菌感受態細胞。

4. 將重組質粒轉化到芽孢桿菌感受態細胞中，涂對應的抗性平板，37 ℃ 培養過夜。

5. 挑取單克隆轉化子進行鑒定，篩選出理想的目的菌株。

6. 將目的菌株接入 10 mL 液體培養基中擴大培養作為一級種子液。

7. 取 5 mL 的一級種子液接入 100 mL 液體培養基中，在 37 ℃ 培養至 OD600=0.8~1.0，加入誘導劑（誘導劑的終濃度為 1%），37 ℃，200 rpm/min 培養 12 h 結束發酵。

8. 取培養中不同時間溫度表達的蛋白進一步做蛋白分析，選擇最優的表達條件。

9. 進行放大培養并純化蛋白。

注意事項

（1）芽孢桿菌擁有很強的胞外蛋白分泌能力，其外源蛋白的表達量并不是很高，需要進行發酵條件篩選。

（2）接種量根據實驗具體情況而定，誘導時間根據表達蛋白的具體情況而定，選擇合適的表達溫度和時間。

（3）芽孢桿菌最常見的誘導性啟動子是受 IPTG 誘導的啟動子和受木糖誘導的啟動子。

常見問題

（1）芽孢桿菌的野生菌會產生大量的胞外蛋白酶，容易使目標產物在被降解。因此可使用蛋白酶缺陷型菌株以提高外源蛋白的表達水平。

（2）注意表達載體缺乏，載體不穩定、蛋白質易變性等問題。