細(xì)胞 DNA 損傷檢測(cè)

原理

細(xì)胞 DNA 鏈斷裂時(shí)，DNA 的超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在中性條件時(shí)，DNA 片段可進(jìn)入凝膠發(fā)生遷移，而在堿處理和堿性電解質(zhì)的作用下，DNA 發(fā)生解螺旋，損傷的 DNA 斷鏈及片段被釋放出來，由于這些 DNA 的分子量很小，所以在電泳過程中會(huì)離開核 DNA 向陽極移動(dòng)，形成彗星狀的拖尾圖像，而未損傷的 DNA 部分停留在原位，染色后成圓形熒光團(tuán)。

用途

評(píng)價(jià)單個(gè)細(xì)胞的 DNA 損傷（各種因素的生物反應(yīng)、腫瘤的研究治療預(yù)測(cè)）。

材料與儀器

【試劑】低熔點(diǎn)瓊脂糖、正常熔點(diǎn)瓊脂糖

PBS、TBE（5X）、溴化乙錠（EB）

Tris-HCl 溶液、RIPA 細(xì)胞裂解液

載玻片、蓋玻片

【設(shè)備】熒光顯微鏡、核酸電泳儀

步驟

1、單細(xì)胞懸液制備

用胰酶將細(xì)胞消化至離心管中并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用 PBS 調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至 105~106 個(gè)/ml。

2、制膠

第一層使用 80 μl 0.5% 正常熔點(diǎn)瓊脂糖滴到預(yù)熱的載玻片上，迅速蓋上干凈的蓋玻片，4 ℃ 放置 10 min 使其凝固。

第二層是低熔點(diǎn)瓊脂糖與細(xì)胞的混合液，取 10 μl 含 10000 個(gè)細(xì)胞的 PBS 和 75 μl 0.5% 低熔點(diǎn)瓊脂糖在 37 ℃ 混勻，然后輕輕揭去蓋玻片，將含細(xì)胞的低熔點(diǎn)瓊脂糖滴到第一層膠板上，立即蓋上干凈的蓋玻片，4 ℃ 放置 10 min 使其凝固。

第三層膠制備同第一層膠一致，蓋上蓋玻片。

3、裂解

移去蓋玻片，將載玻片浸入新配置的 RIPA 細(xì)胞裂解液中至少裂解 2.5 h（盡量使每張玻片裂解時(shí)間相同）。此步驟的目的是裂解液由去垢劑及高鹽溶液組成，除去溶解細(xì)胞膜及核膜，除去蛋白質(zhì)、RNA 等，僅存留核骨架。

4、解旋和電泳

細(xì)胞裂解后，取出載玻片，用 PBS 沖洗 2 次，然后將載玻片置于水平電泳槽中，倒入 1XTBE 電泳緩沖液，覆膠面 0.25 cm，堿解旋 20 min，4 ℃ 冰箱中電泳 25~30 min，電壓 25 V。

5、染色

將載玻片取出，濾紙吸干電泳緩沖液，用 Tris-HCl（pH 7.5）中和 15 min。然后每片載玻片上滴加 50 μl 30 μg/mL 的溴化乙錠（EB）溶液，避光操作，蓋上蓋玻片，避光染色 20 min，即可觀察。

6、鏡檢核圖像分析

EB 染色后的樣本盡快在熒光顯微鏡下觀察并拍照電泳圖譜。

注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞消化不徹底，沒有得到單個(gè)細(xì)胞，多個(gè)細(xì)胞發(fā)生粘連。

2、尾巴形狀不完全或者發(fā)生扭曲。

3、裂解液處理是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，裂解液要澄清且完全溶解，裂解不徹底要延長(zhǎng)裂解時(shí)間或考慮使用強(qiáng)裂解液。

4、溴化乙錠是劇毒物質(zhì)，需做好防護(hù)，可考慮用其他核酸染料替代。

常見問題

問題1：細(xì)胞消化不徹底，沒有得到單個(gè)細(xì)胞，多個(gè)細(xì)胞發(fā)生粘連。

答：細(xì)胞消化過程在孵箱中進(jìn)行消化，可以用移液槍輕輕吹吸。

問題2：尾巴不完整或者發(fā)生扭曲。

答：制膠過程細(xì)致小心，不要產(chǎn)生氣泡、膠面平整。剝膠過程小心細(xì)致。電泳保持在低電壓且電壓平穩(wěn)，在 4 ℃ 冰箱里電泳。