表皮細胞培養(yǎng)實驗

原理

利于皮膚表皮細胞培養(yǎng)成功的因素有，在有膠原的底物上易生長；另有人發(fā)現(xiàn)把人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3 細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）上時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細胞生長。向培養(yǎng)基中加氫化可的松（ 10 μg/ml ）、10-10 的霍亂毒素、10M-6 的異丙基腎上腺素（Isopro-terenol）和10 ng/mI 促表皮生長因子（EGF）能促表皮細胞生長。

材料與儀器

皮膚 血清
EDTA 胰蛋白酶 Eagle
血管鉗 吸管 CO2溫箱

步驟

皮膚是皮表細胞培養(yǎng)來源，小兒包皮是皮膚表皮細胞培養(yǎng)的好材料。全皮培養(yǎng)時，表皮細胞與成纖維細胞混合生長，難以純化。黑木登志夫（1981）用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲純上皮細胞，有一定參考價值，其法如下：

1.  取材
取外科植皮或手術殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成 0.5~1 平方厘米小塊；

2.  EDTA處理
先置入0.02 %EDTA 中室溫置5 分鐘；

3.  冷消化
換入0.25 %胰蛋白酶中，置4 ℃過夜；

4.  分離
取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開；

5.  溫消化
取出表皮單獨處理，用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25 %胰蛋白酶中，37 ℃再消化30~60 分鐘；

6.  用吸管輕輕反復吹打，使成細胞懸液；

7.  培養(yǎng)液
通過80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和 20 %小牛血清，制成細胞懸液，接種入碟皿中，CO2溫箱培養(yǎng)。

注意事項

冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散，如冷消化后分離下來的表皮膜自身也已松散，此時亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細胞懸液；不再經(jīng)過第二次消化。

常見問題

皮膚表皮培養(yǎng)亦可用全皮消化法或組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。用膠原酶消化為好，它對結(jié)締組織有較強消化作用，對表皮細胞損傷小，但成纖維細胞易與上皮細胞同時生長，在這種情況下，需做排除成纖維胞處理。血清中含有血小板來源的生長因子（PDGF），易促成纖維細胞的生長；如用好的、不含PDGF的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可能更好。