腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

原理

在體外培養(yǎng)基中由一個(gè)祖先細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞團(tuán)，稱之為集落。腫瘤細(xì)胞能無限繁殖，所以具有這種能力，而成熟分化的細(xì)胞則不能形成集落。

HL-60細(xì)胞是一種急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，在體外無需加刺激因子，可在軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落。二甲基亞砜是一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，經(jīng)二甲基亞砜處理后的HL-60細(xì)胞按粒系途徑定向成熟分化，同時(shí)細(xì)胞的增殖力降低，幾乎全部細(xì)胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。

材料與儀器

HL-60細(xì)胞
小牛血清 RPMI1640培養(yǎng)液 臺(tái)盼蘭 瓊脂 二甲基亞砜
超凈工作臺(tái) 二氧化碳培養(yǎng)箱 顯微鏡 培養(yǎng)瓶 吸管 酒精燈 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 多孔培養(yǎng)板

步驟

1.  收集對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，先按實(shí)驗(yàn)十三測定細(xì)胞活力，然后調(diào)整細(xì)胞濃度，制成300~1 000活細(xì)胞/ml 的細(xì)胞懸液。

2.  取二個(gè)培養(yǎng)瓶每個(gè)瓶中加9 ml 調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液，然后各加入1 ml 3%瓊脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混勻。

3.  用微量加樣器吸140 ul 二甲基亞砜（MDSO），加到一個(gè)瓶中，充分混勻，為實(shí)驗(yàn)組，另一瓶不加DMSO，為空白對照組。

4.  取一個(gè)16 mm 多孔培養(yǎng)板，每孔加1 ml（35 mm 培養(yǎng)皿需加2 ml）細(xì)胞瓊脂懸液，勿有氣泡，將實(shí)驗(yàn)組和對照組分兩組加好，蓋上蓋并作好標(biāo)記。

5.  在室溫放置20分鐘使細(xì)胞瓊脂懸液凝固。

6.  然后移培養(yǎng)板或平皿于CO2培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

7.  培養(yǎng)7~10天，肉眼觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。

8.  結(jié)果：以肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)（含500個(gè)以上細(xì)胞）作為計(jì)數(shù)集落的標(biāo)準(zhǔn)。對照組HL-60細(xì)胞在含0.3%的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長良好，每個(gè)孔中可見有多個(gè)集落形成，而實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞因經(jīng)二甲基亞砜誘導(dǎo)分化，細(xì)胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。

9.  集落的計(jì)數(shù)和計(jì)算：

（1）集落數(shù)=n孔中細(xì)胞集落數(shù)總和/n孔

（2）集落形成率=集落數(shù)/接種培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)x100%

注意事項(xiàng)

1.玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒：1）高壓蒸汽滅菌15分鐘以上，2）干烤消毒140度2小時(shí)以上。

2.消化液（pH7.8）或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存。

3.無菌工作臺(tái)先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時(shí)以上。

4.培養(yǎng)基（pH7.2）和血清配制好后要做無菌試驗(yàn)：將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存。

5.培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應(yīng)照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來菌），至少每月一次。

6.進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時(shí)注意無菌臺(tái)內(nèi)空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數(shù)量較多，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離，開瓶（蓋）時(shí)應(yīng)先用75%酒精反復(fù)擦拭或用燈燒，打開后應(yīng)用燈先燒口，然后燒蓋。