銀染核仁形成區(qū)的標(biāo)本制備及觀察實(shí)驗(yàn)
原理
生化和免疫化學(xué)研究證明銀染蛋白是RNA聚合酶I，其功能是催化rDNA轉(zhuǎn)錄rRNA形成核仁，因此通過這種反應(yīng)能夠特異顯示rRNA轉(zhuǎn)錄的活性。
材料與儀器
HL-60細(xì)胞 HeLa細(xì)胞
Carnoy固定液 HCl 甲酸 AgNO3 蛋白膠 硫代硫酸鈉 戊二醛 乙醇 丙酮 醋酸鈾 檸檬酸鉛染液
顯微鏡 電子顯微鏡 超薄切片機(jī) 水浴箱 離心機(jī) 天平 染色缸 平皿 乳頭吸管 離心管 擦鏡紙
步驟
一、中期染色體核仁形成區(qū)的銀染和觀察
1. 取制備好的正常或腫瘤細(xì)胞染色體標(biāo)本，直接放入裝有5 N HCl溶液中，常溫處理5分鐘。
2. 用自來水反復(fù)沖洗幾次，甩干，標(biāo)本面朝上平放在平皿中。
3. 將0.1%甲酸臨用前配制的50%AgNO，溶液約0.5 ml，用吸管滴在標(biāo)本上，再蓋上二片擦鏡紙。
4. 放置平皿于56℃水浴中處理3~5分鐘，待擦鏡紙呈棕色后，取出標(biāo)本用水沖洗、氣干。
5. 鏡檢
（1）鏡下所見標(biāo)本背景淺黃色，核型深染，端著絲粒染色體的銀染蛋白存在的部位呈棕黑色顆粒，選擇染色體分散良好，銀染顆粒清楚的分裂相，進(jìn)行計(jì)數(shù)單側(cè)或雙側(cè)有銀染顆粒的染色體數(shù)。
（2）人體細(xì)胞銀染顆粒有遺傳穩(wěn)定性，一般正常值為4~8個(gè)/核型。
（3）計(jì)算方法：NOR 均值=N個(gè)核型中含NOR染色體數(shù)的和/N個(gè)核型
二、間期細(xì)胞核活性核仁形成區(qū)的銀染與觀察
1. 收集培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞和用PHA轉(zhuǎn)化的人正常外周血淋巴細(xì)胞分別于離心管中，用1 000 rpm 離心5分鐘后棄上清。
2. 用吸管吸打或用指彈法使細(xì)胞懸浮，然后用Carnoy固定液固定30分鐘。
3. 以1 000 rpm 離心5分鐘，棄上清剩約0.5~0.1 ml 液體，使細(xì)胞懸浮后滴片。
4. 37℃干燥24小時(shí)
5. 銀染
6. 鏡檢
（1）鏡下所見，細(xì)胞核著色而細(xì)胞質(zhì)不著色，核中活性核仁形成區(qū)銀染顆粒呈棕黑色，成簇聚集，清晰可分。
（2）腫瘤細(xì)胞中與正常細(xì)胞中的銀染顆粒數(shù)量、可見有明顯差異。
三、間期細(xì)胞核銀染活性核仁形成區(qū)電鏡標(biāo)本制備與觀察
1. 收集培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞或HeLa細(xì)胞于離心管中，隨后加入2.5%戊二醛1 ml 預(yù)固定10分鐘。
2. 以1 000 rpm 離心10分鐘，棄上清后加入Carnoy固定液固定5分鐘。
3. 接著以2 500 rpm 離心10分鐘，棄凈上清并用吸水紙吸干殘余液體，用耳勺取出細(xì)胞團(tuán)塊放于小平皿中。
4. 100%乙醇→雙蒸水梯度復(fù)水，每步5分鐘。
5. 然后將細(xì)胞團(tuán)切成約1 mm3大小的塊。
6. 將50%AgNO3（用蒸餾水配制）-2%蛋白膠（用1%甲酸配制）2：1混合液2~3 ml，加入有細(xì)胞團(tuán)塊的小平皿中。
7. 移置平皿于56℃水浴中處理20分鐘。
8. 徹底水洗3次，每次2~3分鐘。
9. 水洗后5%硫代硫酸鈉室溫處理10分鐘。
10. 再水洗3次，轉(zhuǎn)入乙醇一丙酮梯度脫水，每步5分鐘。
11. Epon812包埋。
12. 超簿切片直接地或再經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛復(fù)染后，在電鏡下觀察。
