細胞銅死亡的檢測

簡介

銅依賴性細胞死亡是一種新形式的細胞死亡方式，被定義為非凋亡性細胞死亡途徑。在健康的細胞中，銅離子通過銅轉運蛋白進入細胞內，同時通過線粒體中的氧化還原酶等參與氧化-磷酸化反應，完成細胞代謝過程。

但是當細胞內銅離子濃度過高，或者銅轉運蛋白、氧化還原酶等出現缺失時，過量銅離子就會在細胞內累積，誘導氧化應激、細胞膜 DNA 損壞、從而影響細胞的正常功能，最終導致細胞死亡。

原理

銅直接與三羧酸（TCA）循環的脂酰化組分相結合。然后，這些銅結合的脂化線粒體蛋白發生聚集和 Fe-S 簇蛋白降解觸發了蛋白水毒性應激，最終導致細胞死亡。

用途

幫助人們更好地了解銅離子在細胞內的作用；有助于開發更有效的銅離子調節劑促進細胞代謝和生長；對細胞銅死亡的研究還有助于診斷和治療相關疾病。

材料與儀器

試劑：DMEM 培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、Disulfiram（DSF）、0.25% 胰酶（含 EDTA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、CuCl2 溶液、抗體（FDX1、DLAT、DLST、LIAS、caspase 3、caspase 9、GAPDH 和 HRP）、DAPI 染料、SDS-PAGE 凝膠

步驟

1、將細胞放置在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-鏈霉素的 DMEM 培養基中生長；

2、取對數生長期的細胞，用 0.25% 胰酶消化后收集細胞，用 PBS 重新懸浮調整細胞濃度為 2 × 103 個/孔接種于 96 孔板中；

3、提前 30 分鐘在培養中加入 1 μM 的 CuCl2 溶液，再在每孔中加入 0.05~1.6 μM 的 DSF 處理細胞，并設置空白對照組（即不添加 CuCl2 的 DSF 處理組），置于于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養；

4、在處理細胞 16~24 小時后，重復三次加入 0.05~1.6 μM 的 DSF，72 小時后通過試劑盒測定細胞活力，并在顯微鏡下觀察；

5、將步驟 3 的處理組細胞用 DSF 處理 2 小時后用 PBS 洗滌，用 10% 福爾馬林重懸，在室溫下孵育固定；

6、使用 FDX1 抗體作為一抗孵育細胞，用 PBS 洗去多余的一抗后加入熒光標記的二抗，再用 PBS 緩沖液對細胞進行洗滌，使用核染色劑（DAPI）對樣品進行染色于顯微鏡下觀察；

7、同樣將 DSF 處理 2 小時后的細胞加入蛋白酶抑制劑進行裂解，洗脫蛋白至 SDS-PAGE 凝膠中進行電泳分離，然后轉移至聚丙烯酰胺薄膜中，轉膜封閉后加入一抗（FDX1、DLAT、DLST、LIAS、caspase 3、caspase 9、GAPDH）于 4 ℃ 孵育過夜，然后加入二抗 HRP 室溫搖床孵育 2 小時，洗滌后置于發光成像分析系統中觀察。

注意事項

（1）細胞的培養條件需要嚴格控制，溫度、濕度、CO2 濃度、培養基配方以確保實驗結果的可重復性；

（2）銅離子濃度和處理時間要控制，過高的濃度和長時間的處理都會導致不必要的毒性和干擾，影響實驗結果；

（3）用銅離子載體藥物 DSF 處理時采用電脈沖，避免因藥物誘導癌細胞凋亡和產生氧化應激；

（4）細胞在固定過程中避免因額外壓力或其他因素造成細胞形態和結構的改變，從而影響實驗結果。染色試劑的選擇應基于具體情況進行優化和調整，并注意染色試劑與細胞樣本的兼容性；

（5）蛋白檢測指標中，重點觀察 Fe-S 蛋白的變化，而凋亡相關蛋白的含量不會發生變化，若凋亡相關蛋白有明顯變化應該考慮實驗過程中的操作方法是否有誤。