seahorse 檢測細胞能量代謝狀況

簡介

使用 seahorse 儀器檢測細胞能量代謝狀況，具體包括細胞有氧呼吸和糖酵解。

原理

有氧呼吸和糖酵解是細胞內兩條主要的能量生產途徑，前者可通過加入不同的線粒體電子傳遞鏈藥物來測得細胞呼吸氧耗率，后者則通過加入寡霉素抑制有氧呼吸來測得細胞產酸率。

用途

測量細胞能量代謝，細胞有氧呼吸情況，細胞糖酵解情況。

材料與儀器

Seahorse XFe96 儀器；Seahorse XF 細胞線粒體壓力測定試劑盒

步驟

Seahorse 細胞能量檢測的實驗操作在細胞類型（貼壁或懸浮）、細胞數量、藥物劑量濃度上均可能會有區別，需要在實驗過程中進行調整，以下為貼壁細胞的一種線粒體壓力測試方案：

一、準備工作

1. 接種貼壁細胞：將細胞接種在 XF96 細胞培養板上，每孔 80 μL 培養基，細胞數在 5~20 k/well 為佳，待細胞放入培箱中培養固定 1 h 后，再向每孔加入 70μL 培養基；在背景校正孔中加入 150 μL 培養基，不加細胞；將細胞培養板放入 37 ℃ CO2 細胞培養箱中培養過夜；

2. 水化探針板：在水化板（Utility Plate）中加入 200 μL/孔的無菌水，再放上探針板和蓋子，輕微移動排出氣泡后，在 37 ℃ 無 CO2 細胞培養箱中過夜；同時取出至少 20 mL 的 XF 校準液放入離心管中，37 ℃ 無 CO2 細胞培養箱中過夜；

二、上機檢測

1. Seahorse Xfe96 系統預熱：至少提前 5 小時打開儀器、電腦和軟件進行預熱；

2. 水化探針板：次日去除探針板裝置，棄去 Utility Plate 中的無菌水，每孔加入 200 μL XF 校準液，放上探針板和蓋子后，在 37 ℃ 無 CO2 細胞培養箱中水化 45~60 min；

3. 配置檢測液：配置方法按試劑盒說明書進行，并根據實驗需求進行調整；簡而言之，一塊培養板配置約 100 mL 檢測液（97 mL 103575-100 試劑盒中加入 1 mL glucose（終濃度為 10 mM）、1 mL pyruvate(終濃度為 1 mM)、1 mL glutamine(終濃度為 2 mM)），調整檢測液 PH 至 7.4，然后將使用 0.22 μm 細胞濾器過濾后放入 37 ℃ 溫育備用；

4. 細胞換液：棄去細胞培養板中的培養基（留下 20 μL 覆蓋細胞），加入 200 μL 檢測液清洗 2 遍，徹底去除檢測液，再加入 180 μL 檢測液，將細胞放入 37 ℃ 無 CO2 細胞培養箱中 60 min 等待上機；

5. 配藥：從試劑盒中取出一包藥物，用檢測液進行稀釋，具體見下表

推薦 Oligomycin 上機終濃度為 1.5 μM，Rot/AA 上機終濃度為 0.5 μM，FCCP 上機終濃度為 0~2 μM，2~3 mL 藥物工作液為 10x 濃度裝載入探針板，例如：想獲得終濃度為 1.5 μM 的 Olygomycin，需加入 630 μL 檢測液重懸，混勻后從重懸液中取出 450 μL 并加入 2 550 μL 檢測液配置 3 mL 15 μM 的工作液；

6. 加藥：探針板中每孔加入 20 μL 配制好的藥物，加藥時保持探針板水平，槍頭略傾斜于探針板，槍頭深入孔中但不能沒入液體，藥物不能掛壁；加藥順序為：（實驗所需細胞藥物）-Oligomycin-FCCP-Rot/AA。

7. 上機運行：根據實驗設計完成組定義設置，StartRun 運行實驗，按照提示將去掉蓋子的探針板防止于托盤上，進行校準（約 20 min）；校準完畢后將 Utility Plate 換成細胞培養板，并開始進行細胞能量代謝測試，測量結束后點擊 Eject 取出細胞培養板和探針板，并對數據進行歸一化處理。

注意事項

細胞狀態最為重要，需要培養好細胞；貼壁細胞貼壁后細胞匯合度達 80~90% 為佳，并且細胞數量與藥物濃度之間的比例需要把控好，做到能夠檢測到合適范圍的氧耗率或產酸率，又不會過度抑制細胞活性。

常見問題

1. 探針板的水化時間？

4~72 小時，建議過夜。

2. 檢測液中可以加入血清嗎？

不建議加入，血清會影響檢測液的緩沖能力，也可能與藥物發生非特異性結合而影響檢測效果。

3. 溶好的藥物可以使用多長時間？

藥物和檢測液建議現用現配。

4. 加入 FCCP 后，OCR 沒有升上去？

需要考慮是否細胞活性不佳，或者 Oligomycin 加入過多抑制了最大呼吸。

5. FCCP 劑量摸索如何設置？