細(xì)胞系培養(yǎng)與傳代（HK-2 為例）
簡(jiǎn)介
人腎小管上皮細(xì)胞 HK-2 屬源于正常腎的近曲小管細(xì)胞，通過導(dǎo)入 HPV-16 E6/E7 基因而獲得永生化。
用途
用于 HK-2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
材料與儀器
CO2 培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈臺(tái)、離心機(jī)、37 ℃ 水浴鍋、HK-2 細(xì)胞、DMEM/F12 培養(yǎng)基、FBS、0.25% 胰酶、PBS、培養(yǎng)皿、15 mL 離心管、凍存管、記號(hào)筆。
步驟
1、細(xì)胞復(fù)蘇：
從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞凍存管，迅速置于 37 ℃ 水浴鍋中，輕微搖晃凍存管使細(xì)胞凍存管中的培養(yǎng)液快速融化（最好在 1 min 內(nèi)完成），隨后 1 000 rpm 離心 5 min，小心從離心機(jī)中取出細(xì)胞凍存管；
放入超凈工作臺(tái)中，棄去凍存管中的上清溶液，然后加入 1 mL 完全培養(yǎng)基（90% DMEM/F12+10% FBS），用移液器將細(xì)胞吹成單個(gè)細(xì)胞懸液，吹打時(shí)動(dòng)作輕柔，將細(xì)胞懸液移轉(zhuǎn)至無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入適量完全培養(yǎng)基，置于 37 ℃ 5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、細(xì)胞傳代：
在顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度，細(xì)胞長(zhǎng)至 80% 左右可以考慮傳代，如細(xì)胞較稀，請(qǐng)及時(shí)換液。從 CO2 培養(yǎng)箱取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，用移液槍吸棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的陳舊培養(yǎng)基，使用事先預(yù)熱至 37 ℃ 的 PBS 溶液洗滌細(xì)胞兩次并棄去以消除血清對(duì)后續(xù)胰酶的中和作用的影響。
加入 1~2 mL 的胰酶消化細(xì)胞，輕微搖晃細(xì)胞培養(yǎng)皿，使得胰酶能完全浸潤(rùn)細(xì)胞表面，在顯微鏡下觀察細(xì)胞（注意不同細(xì)胞的消化時(shí)間不同，放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱可促進(jìn)胰酶消化活性）；
待細(xì)胞回縮變圓、細(xì)胞間隙增大后（HK-2 細(xì)胞大概 1~2 min，注意盡量避免細(xì)胞大面積從培養(yǎng)皿底部脫落，防止消化過度），棄去胰酶，加入 1~2 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面吹下，輕柔吹打細(xì)胞形成單個(gè)細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液混勻后分狀至新的細(xì)胞培養(yǎng)皿，并加入適量完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
3、細(xì)胞凍存：
事先配好細(xì)胞凍存液（完全培養(yǎng)液 92%，DMSO 8%）。將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞按照細(xì)胞傳代步驟進(jìn)行消化，將細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液后，收集細(xì)胞至 15 mL 離心管中，1 000 rpm 離心 5 min，棄去上清，加入上述細(xì)胞凍存液，使用移液器吹吸混勻后，加入無菌細(xì)胞凍存管中；
在凍存管上標(biāo)注細(xì)胞名稱及凍存時(shí)間后，4 ℃ 放置 1 h，-20 ℃ 放置 2 h，-80 ℃ 放置過夜后（也可將細(xì)胞放入常溫的細(xì)胞凍存盒后，直接放入 -80 ℃ 冰箱過夜），置于液氮罐中長(zhǎng)期保存，注意做好標(biāo)記。
注意事項(xiàng)
1、細(xì)胞操作都需在無菌條件下操作，嚴(yán)防污染。
2、HK-2 細(xì)胞對(duì)血清質(zhì)量要求高，推薦使用優(yōu)等胎牛血清。
3、在細(xì)胞復(fù)蘇操作時(shí)，應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快，而在細(xì)胞凍存時(shí)，要逐步降溫凍存或者放入細(xì)胞凍存盒中，遵循慢凍速溶原則
4、HK-2 細(xì)胞為上皮細(xì)胞樣貼壁細(xì)胞，在甲基纖維素、軟瓊脂上不生長(zhǎng)且不能懸浮培養(yǎng)。
5、HK-2 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢并且需要一些時(shí)間才能貼壁。在培養(yǎng)基中看到許多圓形、漂浮和折射細(xì)胞是正常情況，不應(yīng)丟棄松散附著和圓形的漂浮細(xì)胞，收集離心后可重新加入到培養(yǎng)皿中。
6、HK-2 細(xì)胞培養(yǎng)密度不宜過高，建議 80% 密度及時(shí)傳代，2~3 天更換新鮮培養(yǎng)基，按 1:2 至 1:4 進(jìn)行傳代，使用 0.25% 胰酶消化 1~2 分鐘。
