酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定植物激素含量

簡(jiǎn)介

植物的生長(zhǎng)發(fā)育、基因表達(dá)以及對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)均受體內(nèi)激素平衡的制約。但是，由于內(nèi)源激素含量極低，在實(shí)驗(yàn)室中要精確快速測(cè)定是比較困難的。植物激素(planl hormone)的免疫法測(cè)定極大地促進(jìn)了植物激素的研究。

本實(shí)驗(yàn)的目的是掌握酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定植物激素含量的原理及操作，熟悉酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀的使用。

原理

1. 在ELISA中，抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)依靠酶標(biāo)記物來(lái)實(shí)現(xiàn)，常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標(biāo)記激素分子，稱(chēng)為酶標(biāo)植物激素，也可標(biāo)記于第二抗體 (識(shí)別抗激素抗體Fc片段的抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白)，稱(chēng)為酶標(biāo)二抗。這兩類(lèi)標(biāo)記物分別用于固相抗體型和固相抗原型ELISA。

（1) 固相抗體型ELISA：將抗激素的單克隆抗體(MAb)與已吸附于固相載體上的兔抗鼠1 g抗體(RAMIG)結(jié)合，然后加入激素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品,使其與固相化的MAb結(jié)合，再加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記激素(酶標(biāo)激素)。通過(guò)測(cè)定酶標(biāo)激素的被結(jié)合量，可換算出未知樣品中激素的數(shù)量。

(2) 固相抗原型ELISA：將“激素-蛋白”復(fù)合物(該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白)包被于固相載體，加入待測(cè)激素(樣品或標(biāo)準(zhǔn)品)和抗IAA多克隆抗體(PAb)反應(yīng)，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，然后讓HRP標(biāo)記羊抗兔Ig抗體(HRP-GARIG)與結(jié)合在固相上的PAb反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定與固相結(jié)合的酶量，換算出未知樣品中激素的含量。

材料與儀器

材料：

高等植物、真菌、藻類(lèi)等組織或器官。

試劑：

（1）洗滌緩沖液：0.01 mol · L-1 pH 7.4 磷酸緩沖液(PBS)，內(nèi)含 0. 055% Tween-20；

（2）RAMIG溶液或“激素-蛋白”復(fù)合物；

（3）1% 封閉蛋白(該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白)；

（4）抗激素MAb或PAb；

（5）激素標(biāo)準(zhǔn)品母液及參比系列溶液(按雙倍或4倍系列稀釋)；

（6）HRP 標(biāo)記激素或 HRP-GARIG；

（7）鄰苯二胺(OPD)基質(zhì)液：稱(chēng)取 5 mg OPD溶于 5 mL 0.01 mol · L-1 pH 5.0 的磷酸緩沖液中，用前加入30% BAX 12.5 μL。

器材：酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、高速冷凍離心機(jī)、恒溫箱、連續(xù)進(jìn)樣器、渦旋儀

96孔微孔板、離 心管、研缽或勻漿器、試管等。

步驟

酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定植物激素含量的基本過(guò)程可分為如下幾步：

（一） 固相抗體型ELISA

1. 用方陣法滴定選擇各反應(yīng)物最適工作濃度。

2. 將100 μL RAMIG溶液包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔4 °C濕盒，12 h。

3. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

4. 加入100 μl 抗激素 MAb 溶液,37 °C，70 min。

5. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

6. 各孔內(nèi)依次加入50 μL待測(cè)樣液，每個(gè)樣品3次重復(fù)，15~20 °C，20 min。

7. 加入50 μL HRP標(biāo)記激素，37 °C ，60 min。

8. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干。

9. 加入 100 μL OPD 基質(zhì)液，37 °C顯色 15~20 min,加入 50 μL 3mol · L -1 H2SO4，溶液 終止反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm下各孔的A490值，求出每份樣品重復(fù)孔的平均值。

10. 用激素標(biāo)準(zhǔn)品母液和參比系列溶液.在同一微孔板上同上法操作。

（二） 固相抗原型ELISA

1. 用方陣法滴定選擇各反應(yīng)物最適工作濃度。

2. 將100 "激素-蛋白" 復(fù)合物溶液包被于微孔板，37 °C,12 h。

3. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

4. 加入100 μL 1% 封閉蛋白溶液封閉,37 °C,30 min。

5. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

6. 各孔同時(shí)加入50 μL樣液和50 μL抗激素PAb溶液，以加入正常兔血清溶液的孔（非特異吸附孔）為空白調(diào)零，37 °C,60 min。

7. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

8. 加入 100 μL HRP-GARIG 溶液,37 °C，60 min。

9. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

10. 隨后的顯色、中止與比色程序同上。

11. 用激素標(biāo)準(zhǔn)品母液和參比系列溶液，在同一微孔板上同上法操作。

（三） 結(jié)果計(jì)算

1. 因相抗體型ELISA。

（1) 以加入激素母液的孔（非特異吸附孔）為空白調(diào)零，以加入不含激素的PBS的孔為B0

孔，以加入激素標(biāo)準(zhǔn)參比系列溶液的各孔為 Bi 孔。以標(biāo)準(zhǔn)激素物質(zhì)的量的常用對(duì)數(shù)lg n為橫坐標(biāo)（x），對(duì)應(yīng)的 ln [Bj/（Bo - Bj）] 為縱坐標(biāo)（y），可得一條直線y =a +bx。

（2) 將樣品孔的人傾值代入上式，換算出待測(cè)樣品中激素的物質(zhì)的量，乘以稀釋倍數(shù)，除 以樣品重量，即為每克樣品的激素含量。

2. 固相抗原型ELISA。

以加入不含激素的磷酸緩沖液的孔為Bo孔，以加入激素標(biāo)準(zhǔn)參比系列溶液的各孔為Bj孔，標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算與結(jié)果分析同上。

注意事項(xiàng)

1. 注意: 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀的原理及使用方法。

2. 必須了解所采用抗體的特異性，未經(jīng)過(guò)嚴(yán)格交叉反應(yīng)試驗(yàn)的抗體不能用于免疫檢測(cè)，否則會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。