高效液相色譜法測定植物的內(nèi)源激素含量
簡介
植物內(nèi)源激素對植物的生長發(fā)育起著極其重要的調(diào)控作用，極微量就表現(xiàn)出明顯的生理作用。但由于植物體內(nèi)源激素濃度很低，而且植物體成分復(fù)雜，干擾組分多，分離時易被破壞，給激素的分析測定工作帶來許多困難。
酶聯(lián)免疫法檢測植物內(nèi)源激素靈敏度高但重復(fù)性較低，高效液相色譜法適用于多類不同性質(zhì)化合物的測定和分離，具有靈敏度高，選擇性、重復(fù)性好及分析速度快等特點(diǎn)，是較為理想的植物內(nèi)源激素分析方法。本實(shí)驗(yàn)介紹生長素（IAA）、赤霉素（GA）、玉米素（ZR）和脫落酸（ABA）四種激素的提取和測定方法。
原理
高效液相色譜法在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，具有高壓、高 速、高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。色譜儀中的分離系統(tǒng)包括固定相和流動相，溶于流動相的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱程度不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測。
材料與儀器
材料：
小麥或水稻等植物葉片
試劑：
100% 甲醇（色譜純）、80% 甲醇（分析純）、石油酷、乙酸乙酯、生長素、赤霉素、玉米素、脫落酸標(biāo)準(zhǔn)品
器材：
Agilent 1200 液相色譜儀、研缽、布氏漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥器、分液漏斗、濾紙、微 量注射器、0.45 μm 微孔濾膜
步驟
高效液相色譜法測定植物的內(nèi)源激素含量的基本過程可分為如下幾步：
1. 試驗(yàn)材料的處理：
稱取 1~2 g 樣品，在冰浴下研磨成漿，加入 80% 的預(yù)冷甲醇 20 mL，保鮮膜密封，在 4 °C 冰箱里冷浸過夜。浸提液抽濾，10 mL 甲醇潤洗研缽 2 次，過濾后與浸提液合并，40 °C 下減壓蒸發(fā)至沒有甲醇?xì)堄唷ＪＳ嗨嗤耆D(zhuǎn)移到三角瓶中。
用 30 mL 石油醚萃取脫色 2 次，棄去醚相。加 0. 01 g PVPP（交聯(lián)聚乙烯毗咯烷酮），超聲 30 min，抽濾用 30 mL，乙酸乙酯萃取 3 次，合并酯相，40 °C 下減壓蒸干。用甲醇（色譜純）溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?2 mL，經(jīng) 0.45 微孔濾膜過濾得待測液，保存于 4 °C 冰箱中。
2. 將色譜儀啟動，步驟如下：
（1）打開電腦和色譜各個模塊的電源。
（2）雙擊桌面「儀器一聯(lián)機(jī)」，進(jìn)入聯(lián)機(jī)界面。
（3）手動旋開泵處沖洗閥，右鍵單擊「泵」圖標(biāo)，調(diào)節(jié)流速為 5 mL · min-1，打開所有泵，系統(tǒng)開始沖洗，直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止（一般為 5~10 min），切換通道繼續(xù)遊物生理學(xué)宴驗(yàn)指導(dǎo)沖洗，直到所有要用通道無氣泡為止，設(shè)流速為 0 mL · min -1，手動旋緊沖洗閥。
（4）點(diǎn)擊「方法」一「新建方法」，創(chuàng)建新的方法。右鍵單擊「泵」圖標(biāo)，按照方法要求選擇合 適比例的流動相，設(shè)流速：1.0 mL · min -1 右鍵單擊「檢測器」圖標(biāo)，波長設(shè)置為 254 nm，打開檢測器，待基線穩(wěn)定后約 10 min 即可正式測定。
3. 測定
（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取一定量生長素、赤霉素、玉米素和脫落酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇（色譜純） 溶解，配制成不同濃度的溶液，點(diǎn)擊「運(yùn)行控制」菜單，選擇「運(yùn)行方法」，手動或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣 10~30 ptL，進(jìn)行液相檢測分析。在一定濃度范圍內(nèi)，四種激素峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系時，即可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（2）測定：取同樣量的待測樣品，進(jìn)樣。待樣品峰全部出完后，沖洗 30 min 即可做下一個樣品。
（3）定性：樣品中與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間相同的峰，即為樣品的激素峰。
4. 得到所有樣品色譜圖后，可關(guān)機(jī)。關(guān)機(jī)步驟如下：
（1）關(guān)機(jī)前，用甲醇充分沖洗系統(tǒng)大約 30 min（色譜柱最終應(yīng)保存在甲醇或乙睛中）。
（2）退出化學(xué)工作站，關(guān)閉各泵及其他窗口，關(guān)閉計(jì)算機(jī)。
（3）關(guān)閉液相色譜儀各模塊電源開關(guān)。
5. 通過樣品的峰面積以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中各激素的含量。
注意事項(xiàng)
1. 柱壓上限：建立的液相方法其柱壓上限應(yīng)小于 3800 psi。
2. 流動相的使用：任何流動相必須用 0.45 μm 濾膜抽濾兩遍，其 pH 及流動相的選擇必須在色譜柱允許范圍內(nèi)。
3. 樣品的處理：樣品進(jìn)樣前必須過 0.45 μm 的濾膜，其 pH、分子量大小、在流動相中的溶解性及純度必須符合要求。
