植物組織中游離氨基酸總量的測定

簡介

氨基酸 (amino acid) 是組成蛋白質的基本單位，也是蛋白質的分解產物。植物根 系吸收和同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式進行運輸。所以測定植物組織中不同時期、 不同部位游離氨基酸的含量，對于研究根系生理、氮素代謝等有一定意義。本實驗的目的是 掌握站三酮顯色法測定氨基酸含量的原理和方法。

原理

植物組織中游離氨基酸總量的測定的基本原理是氨基酸的游離氨基與水合站三酮反應 (如下)。首先，氨基酸脫氨脫歿被氧化，水 合帯三酮被還原成還原型站三酮。接著，還原型弗三酮與另一個氧化型帶三酮分子和氨縮合 生成藍紫色化合物，稱為 Ruhemans 紫。其吸收峰為 570 nm, 且在一定范圍內，其顏色深淺 與氨基酸的含量成正比。據此，可用分光光度計在波長 570 nm 下測定反應產物的吸光度值, 根據標準曲線計算岀未知樣品中氨基酸的總量。脯氨酸與站三酮反應生成黃色物質，需另行測定。

材料與儀器

材料：各種植物組織。

器材：分光光度計，恒溫水浴，天平，容量瓶，漏斗，三角瓶，研缽，具塞刻度試管，移液 管等。

試劑：

(1) 水合站三酮試劑：稱取 0.6 g 再結晶的茹三酮置于燒杯中，加入 15 mL 正丙醇，攪拌 使其溶解。再加入 30 mL 正丁醇及 60 mL 乙二醇，最后加入 9 mL pH 5.4 的乙酸-乙酸鈉緩 沖液，混勻，貯于棕色瓶中，置冰箱中保存備用，10 天內有效。

(2)pH 5. 4 乙酸-乙酸鈉緩沖液：稱取結晶乙酸鈉 54. 4 g, 加 100 mL 無氨蒸餡水，在電爐 上加熱至沸，使體積蒸發至原體積的一半。冷卻后加 30 mL 冰乙酸，用無氨蒸循水定容至 100 mL。

(3) 標準氨基酸溶液：稱取 80C 下烘干的亮氨酸 46.8 mg, 溶于少量 10% 異丙醇中，用 10% 異丙醇定容至 100 mL。取此液 5 mL, 用無氨蒸個水稀釋至 50 mL, 即為含氮 5 昭- mL1 的標準氨基酸溶液。

(4)0. 1% 抗壞血酸：稱取 50 mg 抗壞血酸溶于無氨蒸餡水中，并定容至 50 mL, 隨用 隨配。

(5)10% 乙酸：用無氨蒸餡水配制，按 V/V 計。

步驟

植物組織中游離氨基酸總量的測定的基本過程可分為如下幾步：

1. 標準曲線制作：取 6 支 20 mL 具塞刻度試管，編號，按表 51-1 添加試劑。混勻，蓋上玻 塞，置沸水浴中加熱 15 min, 然后取出放在冷水浴中迅速冷卻并經常搖動，使加熱時形成的紅 色逐漸被空氣氧化而褪色，直至溶液呈藍紫色時，加 5 mL 無氨蒸餡水，混勻，用光徑 1 cm 的 比色杯，在波長 570 nm 下測定其吸光度值。以氨基態氮量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪 制標準曲線。

表 51-1 標準曲線制作加樣表

2. 樣品提取: 取新鮮植物樣品，洗凈、擦干并剪碎、混勻后，迅速稱取 0.5?1.0 g, 于研缽 中加入 5 mL 10% 乙酸，研磨成勻漿后，用無氨蒸餡水定容至 100 mL, 搖勻，上清液用干濾紙 過濾到三角瓶中備用。

3 . 樣品測定：吸取上清液 1 mL, 放入 20 mL 具塞刻度試管中，加無氨蒸餡水 1 mL, 其他 步驟與制作標準曲線操作相同，測定樣品液的吸光度值，根據吸光度值在標準曲線上查得樣 品液的含氮量。

4. 結果計算:

C X V

游離氨基酸含量 (mg?100 g-】FW) = w x ] 00()X100

式中：C 一為從標準曲線上查得的含氮量屮 g；

V 一樣品液總體積?mL；

W■-樣品重?go

注意事項

1. 合格的站三酮應該是微黃色結晶，若保管不當，則顏色加深或變成微紅色，必須重結晶 后方可使用。其方法如下：5 g 站三酮溶于 15 mL 熱蒸餡水中，加入 0.25 g 活性炭，輕輕搖 動，溶液太稠時，可適量加水，30 min 后用濾紙過濾，濾液置冰箱中過夜后即可見微黃色結晶 析出，用干濾紙過濾，再用 1 mL 蒸饞水洗結晶一次，置于干燥器中干燥后貯于棕色瓶中。

2. 氨基酸與站三酮反應十分靈敏，需用無氨蒸憎水。

3. 所生成的顏色在 1 h 內保持穩定，稀釋后應抓緊時間比色，用水稀釋反應生成物時，須 在 0.5 h 內測完。

4. 由于空氣中氧干擾顏色反應，以抗壞血酸為還原劑，可提高反應的靈敏度并使顏色穩 定, 但由于抗壞血酸也可與茄三酮反應，使溶液顯色過深, 故應嚴格掌握加入抗壞血酸的量。

5. 反應時的溫度影響顯色的穩定性，在沸水浴中加熱溫度超過 80°C, 溶液易褪色。在 80°C 水浴中加熱，適當延長反應時間會獲得良好的效果。