細(xì)胞免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Co-IP）

原理

其原理是如果細(xì)胞內(nèi)兩蛋白（A、B）有直接或間接的相互作用時(shí)，那么在溫和的裂解條件下獲得的蛋白樣品中加入 A 蛋白的抗體將 A 蛋白沉淀下來(lái)，在細(xì)胞內(nèi)與 A 蛋白直接相互作用的 B 蛋白或與其間接相互作用的 C 蛋白能一起被沉淀下來(lái)。

使用western blot檢測(cè)沉淀中是否存在 B 或 C 蛋白來(lái)確定 B 或 C 蛋白與 A 蛋白的相互作用。

用途

1.檢測(cè) A、B 蛋白在體內(nèi)是否相互結(jié)合

2.分離與 A 蛋白相互作用的蛋白復(fù)合物

材料與儀器

【樣品和試劑】

293T 細(xì)胞（以該細(xì)胞做轉(zhuǎn)染為例）、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（Flag-A，HA-B) 、flag 抗體、2Ⅹ loading buffer、PBS、Flag-beads、1X TBST、5X SDS loading buffer、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑 A 和 B、RIPA 裂解液；

【實(shí)驗(yàn)儀器】

磁力架、金屬浴、RIPA 裂解液旋轉(zhuǎn)混合儀、WB 實(shí)驗(yàn)相關(guān)設(shè)備。

步驟

一、細(xì)胞的鋪板與轉(zhuǎn)染

1、提前一晚將 293T 細(xì)胞鋪板至 6 cm 皿中，鋪板量以達(dá)到相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑要求為準(zhǔn)；

2、用各實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑將以下質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染 2 皿細(xì)胞：flag 空載+HA-B；flag-A+HA-B；每質(zhì)粒 2 微克。

二、免疫沉淀

1、轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后，收獲細(xì)胞，每皿加入 500 μL 裂解液，收集細(xì)胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超聲破碎細(xì)胞；

2、超聲好后，4℃，12,000 g，離心 30 分鐘，取 400 μL 上清液用于免疫沉淀，80 μL 上清用作總蛋白并加入等體積的 2Ⅹ loading buffer；

3、將 400 μL 上清加入用裂解液清洗了 3 遍的 beads 中，加入0.3-0.5 μg flag 抗體，4℃ 孵育 3-4 小時(shí)；

4、4℃，2,000 g，離心 3 分鐘，去除未結(jié)合的液體，留下 beads 沉淀，用預(yù)冷的蛋白裂解液清洗沉淀 3 次，每次 5 分鐘；

5、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入 60 μL 2Ⅹ loading buffer，和總蛋白一起在沸水中煮沸 15 分鐘。

三、Western Blot 檢測(cè)

1、通過(guò) SDS-PAGE 分離樣品，利用全蛋白樣品作為對(duì)照，檢測(cè) flag-A 和 HA-B 蛋白是否發(fā)生結(jié)合。

注意事項(xiàng)

1.對(duì)于內(nèi)源的 Co-IP 檢測(cè)應(yīng)該用 10 cm 皿來(lái)培養(yǎng)目的細(xì)胞，并維持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)；

2.如果該實(shí)驗(yàn)用于新蛋白的鑒定，應(yīng)注意抗體重鏈和輕鏈的影響；

3.該實(shí)驗(yàn)不能確定蛋白之間的相互作用是直接還是間接的。

常見(jiàn)問(wèn)題

1、陰性有較強(qiáng)的條帶

這有可能是結(jié)合較弱或清洗不干凈導(dǎo)致的

2、內(nèi)源的 Co-IP 實(shí)驗(yàn)結(jié)合較弱或者不結(jié)合

可能是蛋白表達(dá)較弱，建議做過(guò)表達(dá)的 Co-IP