質粒轉化大腸桿菌

材料與儀器

【實驗材料】細胞株 質粒； 【試劑、試劑盒】鏈霉素 青霉素 FCS PBS 胰酶 EDTA 轉染試劑(Lipofectamine TM2000) 胰化蛋白胨 酵母提取物 瓊脂 NaCl NaOH 氨芐青霉素 卡那霉素 質粒提取試劑盒； 【儀器、耗材】高壓滅菌鍋 42℃恒溫水浴鍋 恒溫搖床 無菌培養板 消毒1.5ml離心管 消毒槍頭 無菌操作臺

步驟

一、轉染

 1. 從-70℃ 冰箱中取 200μl 感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上 

 2. 加入質粒 DNA 溶液（含量不超過 50ng，體積不超過 10μl），輕輕搖勻，冰上放置 30 分鐘后。 

 3.42℃ 水浴中熱擊 45s/90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻 3-5 分鐘。 

 4. 向管中加入 1 mlLB 液體培養基（不含 Amp），混勻后 37℃ 振蕩培養 1 小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）。

 5. 將上述菌液搖勻后取 100μl 涂布于含 Amp 的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37℃ 培養 16-24 小時。 

 6.在轉染的同時應做兩個對照： 對照組 

1：以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的 LB 平板上應沒有菌落出現。 對照組 

2：以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液，但涂板時只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。 

二、轉染大腸桿菌的擴增 

1. 從 LB 平板上挑取新活化的單個菌落，接種于 3-5 mlLB 液體培養基中，37℃ 下振蕩培養 12 小時左右，直至對數生長后期。將該菌懸液以 1：100-1：50 的比例接種于 100 mlLB 液體培養基中，37℃ 振蕩培養 2-3 小時至 OD600＝0.5 左右。 

2. 取上述培養液置于冰中 10 min，之后轉移到已滅菌的 50 ml 離心管中再于冰上放置 5 min 

3. 于 4℃ 離心，2700rmp，10 min，棄上清，收集細菌 

4. 質粒的提取 準備大腸桿菌質粒提取盒和擴增的帶質粒大腸桿菌培養液 

5. 質粒鑒定（瓊脂糖凝膠電泳）

 三、質粒轉染細胞株的建立 1. 準備細胞： 貼壁細胞：轉染前 24 h，在 500 uL 無雙抗完全培養基中接種 0.5~2×105個細胞，轉染時細胞融合度為 80 ~ 90% 。 2．對于每個轉染樣品，按下面的方法準備： 

（1）用 50 uL Opti-MEM 稀釋 0.8 ug 質粒 DNA，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 5 min。 

（2）輕輕顛倒混勻轉染試劑，用 50 uL Opti-MEM 稀釋 2.0 uL Lipofectamine TM2000，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 5 min。 

（3）混合轉染試劑和質粒 DNA 稀釋液，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 20 min。注: 轉染復合物一旦形成，應立即加入培養皿中進行細胞轉染。 

（4） 轉染復合物加入到 24 孔細胞板中，100 uL/孔，前后輕搖細胞板混合均勻。 

（5） 將細胞板置于 37℃、5% CO2培養箱中培養 6 h 左右，進行換液，換成含 10% 血清的普通培養基，在 37℃，5％CO2 孵育箱中繼續培養 24 h 左右。 

四、穩定轉染細胞株的篩選 

1.從 37℃，5％CO2孵育箱中取出培養皿，棄去含轉染試劑的培養基，用 PBS 沖洗細胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接種 1/2 的細胞到 100 mm 培養皿中，加入含 500 ug/ml G418 的新鮮培養基，每 2-3 天更換一次新的篩選培養基，每天觀察細胞的死亡情況。 

2.當正常細胞完全死亡后，換用新的不含 G418 的培養基培養。每天觀察細胞生長狀態。 

3.在細胞達到 60% 匯合率時再用含 500 ug/ml G418 的培養基篩選一次。 

4.當細胞達到 90% 以上匯合率時將細胞轉移至培養瓶中繼續培養（轉染后 10~12 天左右）。以后每隔 4~5 天再用含 500 ug/ml G418 的培養基篩選。 

5.直到穩定表達轉染質粒的細胞達到一定數量后可以收集樣品（約轉染后 15 天左右）。以后繼續培養時加入的 G418 濃度降一半。

注意事項

鋪板時要將細胞消化完全混勻，避免細胞堆積生長。