熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

原理

作為一種高效的光學(xué)「分子尺」，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是采用物理方法去檢測(cè)分子間的相互作用的方法，是指兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí)，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前通過(guò)偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移，即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移。

FRET 程度與基團(tuán)質(zhì)檢的空間距離緊密相關(guān)，一般為 7~10 nm 時(shí)即可發(fā)生 FRET；隨著距離延長(zhǎng)，F(xiàn)RET 呈顯著減弱。基團(tuán)之間 FRET 的效率，可以由 E = 1/1 +（R/R0）exp6 反映，其中 R 表示基團(tuán)之間的距離，R0 表示福氏半徑，依賴熒光基團(tuán)發(fā)射譜和淬滅基團(tuán)激發(fā)譜的重疊程度，以及基團(tuán)能量轉(zhuǎn)移的偶極子的相對(duì)方位。

用途

適用于在細(xì)胞正常的生理?xiàng)l件下，驗(yàn)證已知分子間是否存在相互作用，比如細(xì)胞內(nèi)分子間的相互作用、膜蛋白的研究、細(xì)胞膜受體蛋白間的相互作用、細(xì)胞凋亡的研究、核酸檢測(cè)等。

材料與儀器

酶標(biāo)儀、兩種熒光發(fā)色基團(tuán)、細(xì)胞系、質(zhì)粒載體

步驟

以熒光物質(zhì) CFP（供體）-YFP（受體）為例，檢測(cè) AB 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。

1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：構(gòu)建質(zhì)粒載體 CFP-A 和 YFP-B，將檢測(cè)的 AB 蛋白分別偶聯(lián)上熒光蛋白 CFP 和 YFP，并將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)；

2、轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后，去除培養(yǎng)基，并用 4％ 的多聚甲醛固定細(xì)胞 15 分鐘，用 PBS 洗滌兩次；

3、FRET 圖像采集：確定 FRET 配對(duì)的激發(fā)波長(zhǎng)，藍(lán)光被調(diào)諧分別用于探測(cè)最大和最小的供體和受體信號(hào)，其中最大供體信號(hào)和最小受體信號(hào)對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)用于收集雙表達(dá)細(xì)胞的 FRET 信號(hào)。調(diào)整激光變化以便獲取最大 CFP 信號(hào)和最小 YFP 信號(hào)的激發(fā)光波長(zhǎng)，采集供體和受體圖像，收集 FRET 信號(hào)。每個(gè)細(xì)胞 FRET 檢測(cè)重復(fù) 3 次，每種轉(zhuǎn)染至少完成 6 個(gè)細(xì)胞的 FRET 檢測(cè);

4、FRET 數(shù)據(jù)處理：對(duì)于圖像分析和系數(shù)計(jì)算，每張圖片要減去背景，去除 FRET 信號(hào)中 DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號(hào)；另外受體通路的 FRET 信號(hào)需要對(duì)供體受體光譜靈敏度的變化進(jìn)行矯正、對(duì)自發(fā)熒光和光學(xué)噪聲進(jìn)行矯正；同時(shí)利用矯正系數(shù)對(duì)雙標(biāo)定細(xì)胞進(jìn)行像素匹配矯正。

注意事項(xiàng)

1. 供體熒光基團(tuán)和受體熒光基團(tuán)的空間距離要<10 nm，足夠接近；

2. 供體的發(fā)射光譜與受體的接收光譜要有相當(dāng)?shù)闹丿B；

3. 能量供體與能量受體的熒光生色團(tuán)必須以適當(dāng)?shù)姆绞脚帕小?/span>