自噬體與線粒體免疫熒光共定位
原理
將自噬體和線粒體特異性蛋白的基因與熒光蛋白基因連接起來構成融合基因，導入細胞內表達，借助熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡對標記蛋白進行細胞內活體跟蹤，可對自噬體和線粒體進行共定位可視化分析。
用途
觀察線粒體自噬的動態(tài)變化。
材料與儀器
細胞、12 孔板
自噬體特異性蛋白 EGFP-LC3
線粒體特異性蛋白 DsRed-mito
無血清培養(yǎng)基、PEI 轉染試劑
熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡
步驟
1、鋪板：取對數(shù)生長期的細胞胰酶消化后鋪 12 孔板，鋪板量以次日轉染時達到 70~80% 左右為宜。
2、轉染：準備兩個 1.5 mL EP 管，分別加入 50 μL 無血清培養(yǎng)基，一管加入適量的 EGFP-LC3 和 DsRed-mito 質粒，另外一管加入 3 倍體積的 PEI 轉染試劑（DNA 質粒量: PEI = 1:3），室溫靜置 5 min 后，將兩個 EP 管里面的液體混合，室溫靜置 15 min 后，將轉染后復合物逐滴緩慢加入到細胞中，4~6 h 后更換為完全培養(yǎng)基。
3、觀察熒光：轉染 24 h 后即可在熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察熒光。在同一視野下，分別在藍色激發(fā)光下觀察自噬體綠色熒光 EGFP-LC3 以及在綠色激發(fā)光下觀察線粒體紅色熒光 DsRed-mito。如有需要可以采用 DAPI 染核，在紫外激發(fā)光下觀察細胞核藍色熒光。最后將 Images 進行 Merge，觀察自噬體和線粒體的熒光共定位情況。
注意事項
1、血清對轉染效率有很大影響，轉染時細胞要采用完全培養(yǎng)基（不含抗生素），并用無血清培養(yǎng)基稀釋質粒 DNA 和轉染試劑。
2、細胞狀態(tài)很關鍵，細胞復蘇后的 3 代左右時細胞狀態(tài)最好，盡量不要用傳過多代的細胞。
