HIV 耐藥檢測(cè)——PCR 法

簡(jiǎn)介

HIV 耐藥性檢測(cè)可以進(jìn)行表型或基因型檢測(cè)，基因型檢測(cè)是最常用的檢測(cè)方法，該方法主要是通過(guò) PCR 及基因測(cè)序的手段得到 HIV 耐藥相關(guān)基因序列，分析基因組中與耐藥相關(guān)的氨基酸突變。

原理

用 PCR 擴(kuò)增 HIV 樣品基因片段（gag、env 和 pol），并對(duì)擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行基因測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，以此確定是否存在耐藥變異。

用途

PCR 檢測(cè)艾滋病患者感染 HIV 病毒的 gag、env 和 pol 基因變異情況，為 HIV 的預(yù)防和治療提供參考。

材料與儀器

PCR 儀、PCR 緩沖液、dNTP 混合物

HIV 的 cDNA、TaqDNA 聚合酶

去離子水、DNA 純化回收試劑盒

PCR 引物、電泳儀

步驟

通過(guò) PCR 法檢測(cè) HIV 耐藥的步驟如下：

1、設(shè)計(jì)引物：選取需要擴(kuò)增的基因片段（gag、env 和 pol）設(shè)計(jì)引物；

2、準(zhǔn)備無(wú)菌的 10 μL、200 μL、1000 μL 槍頭、PCR 管；

3、向 PCR 管中加入 1 μL 的（2.5 mM）4×dNTPs 混合物、5 μL 的 10×PCR 緩沖液、5 μL 的（25 μM）MgCl2、1 μL 上游引物（10 μM）、1 μL 下游引物（10 μM）、0.2 μL TaqDNA 聚合酶、3 μL 的 HIV cDNA，剩余的加去離子水補(bǔ)足到 50 μL，然后混勻；

4、設(shè)置第一輪巢式 PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 3 min，95 ℃  變性 30 s，55 ℃  退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，變性、退火、延伸三個(gè)操作進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 終延伸 5 min，4 ℃ 保存；

5、第二輪巢式 PCR 反應(yīng)：向 PCR 管中加入 1 μL 的（2.5 mM）4×dNTPs 混合物、5 μL 的 10×PCR 緩沖液、5 μL 的（25 μM）MgCl2、1 μL 上游引物（10 μM）、1 μL 下游引物（10 μM）、0.2 μL TaqDNA 聚合酶、5 μL 的第一輪巢式 PCR 產(chǎn)物，剩余的加去離子水補(bǔ)足到 50 μL，然后混勻；

6、設(shè)置第二輪巢式 PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 3 min，95 ℃  變性 30 s，55 ℃  退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，變性、退火、延伸三個(gè)操作進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 終延伸 5 min，4 ℃ 保存；

7、PCR 產(chǎn)物用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后用 DNA 凝膠純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收，用于 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序；

8、將獲得的 HIV 的 PCR 產(chǎn)物送去測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與野生型序列進(jìn)行比對(duì)，判斷是否有耐藥相關(guān)基因突變。

注意事項(xiàng)

引物結(jié)合位點(diǎn)可能出現(xiàn)多位點(diǎn)結(jié)合，可能會(huì)降檢測(cè)的準(zhǔn)確性 ；實(shí)驗(yàn)材料要保證無(wú)菌，避免 PCR 反應(yīng)污染。

常見(jiàn)問(wèn)題

（1）電泳產(chǎn)物出現(xiàn)多條條帶。

（2）模板、引物質(zhì)量不好。