微量組織/細(xì)胞 RNA 提取
簡介
從微量樣本中分離 RNA，微量樣本包括：微量細(xì)胞樣本如低至 1 個細(xì)胞、流式分選細(xì)胞（FACS）樣本；微量組織樣本如低于 2 μg 的組織樣本如穿刺樣本（FNA）、激光顯微切割（LMD）樣本等。
B 圖的結(jié)果顯示，即使是單個細(xì)胞提取的 RNA，依然可以檢測到 β-actin 相對應(yīng)的 CT 值，且隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，相對應(yīng)的 CT 值也隨之表現(xiàn)更好。
原理
RNeasy 系列基于 QIAGEN 經(jīng)典的硅膠膜柱技術(shù)，首先采用了環(huán)保無毒的增強(qiáng)型裂解液 Buffer RLT 進(jìn)行細(xì)胞裂解，在讓細(xì)胞快速破碎完全釋放 RNA 的同時，也能抑制 RNase 酶活性避免 RNA 被降解，相關(guān)操作更加安全、簡便，無需擔(dān)心因傳統(tǒng)酚氯仿方法中的「分層吸液失誤」而導(dǎo)致的實驗失敗，隨后僅需加入乙醇并轉(zhuǎn)移到硅膠膜柱上，使 RNA 與硅膠膜高效結(jié)合。經(jīng)過洗滌后，洗脫得到高純度 RNA。
材料與儀器
RNeasy Micro Kit (QIAGEN)
14.3 Mβ-巰基乙醇（β-ME）或 2 M 二硫蘇糖醇（DTT）的水溶液
乙醇（70% 和 96%—100%）~K~Hp~M~1~Kp~M無菌、無 RNase 的槍頭
離心機(jī)（帶轉(zhuǎn)子，適用于 2 ml 試管）
渦旋儀器
一次性手套
RNA 穩(wěn)定試劑：
細(xì)胞樣本：RNAprotect 細(xì)胞試劑或液氮；
組織樣本：RNAprotect 組織試劑（僅穩(wěn)定 RNA）、Allprotect 組織試劑（穩(wěn)定 DNA、RNA 和蛋白質(zhì)）或液氮；
樣品破碎和均質(zhì)化設(shè)備，根據(jù)所選方法選擇使用：
胰蛋白酶和 PBS；
QIAshredder 均質(zhì)機(jī)；
鈍頭針頭和注射器；
研缽和杵；
TissuerRuptor Ⅱ，帶 Tissuerruptor 一次性探頭；
TissueLyser Ⅲ；
用于徹底去除 gDNA 的 RNase-Free DNase Set。
用于從心臟、肌肉和皮膚組織中純化 RNA，需要用到：
QIAGEN 蛋白酶 K（>600 mAU/ml，溶液）；
可達(dá)到 55°C 的加熱塊或水浴；
步驟
細(xì)胞樣本
1. 可將懸浮培養(yǎng)或單層生長的細(xì)胞收取或直接裂解細(xì)胞。對于組織樣本，新鮮采集的組織樣本、凍存樣本或保存在保護(hù)液中的樣本，確定組織不要使用超過 5 mg。
2. 加入緩沖液 RLT 裂解細(xì)胞。
添加 350 μl 緩沖液 RLT（如果處理細(xì)胞低于 1 x 105，則添加 75 μl 緩沖溶液 RLT）。渦旋或移液器混合。
3. 使裂解物均質(zhì)化。
4. 向裂解液中加入 1 倍體積的 70% 乙醇，用移液器充分混合。不要離心。立即執(zhí)行步驟 5。
5. 將樣品（包括可能形成的任何沉淀物）轉(zhuǎn)移到放置在 2 ml 收集管中的 RNeasy MinElute 硅膠膜柱中。輕輕蓋上蓋子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度離心 15 s。丟棄流出液。
6. 向 RNeasy MinElute 硅膠膜柱中加入 350μl 緩沖液 RW1。輕輕蓋上蓋子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度離心 15 s，清洗硅膠膜柱。丟棄流出液。
可選：如果不需要柱上 DNA 酶消化，則加入 700 μl 緩沖液 RW1，在 ≥ 8000 x g 下離心 15 s，然后丟棄流出液和收集管。_繼續(xù)執(zhí)行步驟 10。
7. 將 10μl DNase I 儲備溶液加入 70 μl 緩沖液 RDD 中。輕輕翻轉(zhuǎn)試管進(jìn)行混合。
8. 將 DNase I 孵育混合物（80μl）直接加入 RNeasy MinElute 硅膠膜柱中，并放置（20-30°C）15 min。
9. 向 RNeasy MinElute 硅膠膜柱中加入 350μl 緩沖液 RW1。輕輕蓋上蓋子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度離心 15 s，清洗硅膠膜柱。丟棄流出液和收集管。
10. 將 RNeasy MinElute 硅膠膜柱放入新的 2 ml 收集管中。向硅膠膜柱中加入 500 μl 緩沖液 RPE。輕輕蓋上蓋子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度離心 15 s，清洗硅膠膜柱。丟棄流出液。
11. 向 RNeasy MinElute 硅膠膜柱中加入 500μl 80% 乙醇。輕輕蓋上蓋子，以 ≥ 8000 x g（≥ 10000 rpm）的速度離心 2 min，清洗旋硅膠膜柱。丟棄流出液和收集管。
注意：離心后，小心地從收集管中取出 RNeasy MinElute 硅膠膜柱，使柱不接觸流出液。否則會出現(xiàn)乙醇?xì)埩簟?/span>
12. 將 RNeasy MinElute 硅膠膜柱放入新的 2 ml 收集管中。打開硅膠膜柱的蓋子，全速離心 5 min。丟棄流出液和收集管。
干燥硅膠柱膜很重要，因為殘留的乙醇可能會干擾下游反應(yīng)。打開蓋子進(jìn)行離心，確保 RNA 洗脫過程中無乙醇?xì)埩簟?/span>
13. 將 RNeasy MinElute 硅膠膜柱放入新的 1.5 ml 收集管中。將 14μl 無 RNase 的水直接添加到硅膠膜的中心。輕輕蓋上蓋子，全速離心 1 min 以洗脫 RNA。
注意：不要用少于 10 μl 的無 RNase 水洗脫。
注意事項
1. 如采樣后不能立即開展 RNA 提取實驗，可使用 RNA protect 保護(hù)液穩(wěn)定樣本中的 RNA。
2. 當(dāng)樣本為低于 500 個細(xì)胞或低于 2 μg 的組織時，建議在細(xì)胞裂解液中加入適量的 Carrier RNA，增加總 RNA 的回收率。
3. 如果樣本含有高濃度的 RNase, 或是組織樣本， 請把 10μlbeta 巰基乙醇或 20 μl 2M DTT 加到 1 ml RLT 裂解液里。此混合液可在室溫收藏 1 個月。
4. 使用前請往 RPE 加入 4 倍等體積的無水乙醇。
5. DNase I 母液： 使用注射器和針往干分裝 DNase I 加入 550μlRNase-free 水。顛倒混勻， 不要渦旋震蕩。 DNase I 可以收藏在-20℃ 收藏 9 個月； 2℃-8℃ 6 周。不能反復(fù)凍溶。
