單細(xì)胞/微量核酸擴(kuò)增方案
簡介
單細(xì)胞測序可以研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因情況，同時(shí)解決了用組織樣本測序無法解決的細(xì)胞異質(zhì)性難題。但是我們常提到的單細(xì)胞測序方案并不是僅對(duì)單個(gè)或者幾個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測序，而是在單細(xì)胞分辨率下對(duì)成千上萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測序。那么如果真的只有一個(gè)細(xì)胞或極微量的核酸，又該采用什么手段對(duì)其基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析呢？單細(xì)胞/微量核酸擴(kuò)增方案可以富集核酸樣本，應(yīng)對(duì)后續(xù)各種分子研究。
原理
基于 MDA（多重置換擴(kuò)增）技術(shù)，支持從單細(xì)胞或微量 DNA 開始進(jìn)行全面均一的基因組擴(kuò)增（針對(duì) RNA 擴(kuò)增需要先反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，詳情請(qǐng)咨詢工作人員）。MDA 擴(kuò)增技術(shù)依靠的 Phi 29 聚合酶是一種特殊的 DNA 聚合酶，其能夠以基因組 DNA 作為模板而實(shí)現(xiàn)長達(dá) 100 kb 的連續(xù)擴(kuò)增，并可保證不從基因組模板上脫離。相對(duì)于傳統(tǒng) PCR 的擴(kuò)增方法，Phi 29 聚合酶因具有 3'→5'的外切酶校準(zhǔn)活性而在擴(kuò)增時(shí)具有比 Taq 聚合酶高 1000 倍的保真性。MDA技術(shù)在耐受外切酶活性引物存在的條件下可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種哺乳動(dòng)物以及細(xì)菌DNA 的高產(chǎn)量擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物后續(xù)可用于 NGS、三代測序、芯片、PCR 等多種分析方案。
材料與儀器
REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN)
Vortex 漩渦震蕩儀
PCR儀
步驟
1. 從單細(xì)胞樣本中擴(kuò)增全基因組 DNA
1.1 根據(jù)需要進(jìn)行的全基因組擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)準(zhǔn)備足夠的變性工作液 2（參照表 1）
注意：表 1 中的變性工作液 2 量足夠 12 次反應(yīng)，剩余的變性工作液 2 可以在 -20℃保存不超過 3 個(gè)月。
1.2 將 4 μL 的起始細(xì)胞樣本液（保存于 PBS 中）加入到一微型離心管中。如果起始細(xì)胞液體積少于 4 μL，則通過加入 PBS sc（磷酸鹽緩沖液）使得終體積至 4 μL。
1.3 加入 3 μL 的變性工作液 2，并通過輕彈離心管及簡短離心來均勻混合各種液體。
1.4 在 65℃ 條件下孵育 10 min。
1.5 加入 3 μL 的 Stop Solution（終止液），通過輕彈離心管及簡短離心來均勻混合各種液體后，置于冰上。
1.6 將 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）置于冰上解凍，并將其他試劑在室溫解凍，渦旋后簡短離心。
1.7 根據(jù)表 2 來準(zhǔn)備預(yù)混液，混勻后簡短離心。
1.8 對(duì)于每個(gè)反應(yīng)，在 10μL 的變性 DNA 溶液（1.5 步后）中加入 40 μL 的上述預(yù)混液。
1.9 30℃ 孵育 8 h。
1.10 將 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）在 65℃ 失活 3 min。
1.11 如果不需要立即使用，可將擴(kuò)增后的 DNA 放在 4℃ 短期保存或放置在-20℃長期保存。擴(kuò)增后的 DNA 產(chǎn)量一般在 40 μg 每 50μL 反應(yīng)，并且需要按照一定的適當(dāng)比例進(jìn)行稀釋。光學(xué)濃度（OD）測定會(huì)高估擴(kuò)增 DNA 的產(chǎn)量。
2. 對(duì)純化后的基因組 DNA 進(jìn)行全基因組擴(kuò)增
2.1 根據(jù)需要進(jìn)行的全基因組擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)準(zhǔn)備足夠的變性工作液 1（參照表 3 和表 4）
注意：表 3 和表 4 中的變性工作液 1 和中和緩沖液量足夠 12 次反應(yīng)，剩余的變性工作液 1 和中和緩沖液量可以在-20℃ 保存不超過 3 個(gè)月。
2.2 將 2.5 μL 的模板 DNA 加入到一微型離心管中。
2.3 加入 2.5 μL 的變性工作液 1，漩渦并簡短離心。
2.4 在室溫孵育 3 min。
2.5 加入 5 μL 的中和緩沖液，渦旋并簡短離心后置于冰上。
2.6 將 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）置于冰上解凍，并將其他試劑在室溫解凍，渦旋后簡短離心。
2.7 根據(jù)表 5 來準(zhǔn)備預(yù)混液，混勻后簡短離心。
2.8 在 10 μL 的變性 DNA 溶液（2.5 步后）中加入 40 μL 的上述預(yù)混液。
2.9 30℃ 孵育 8 h。
2.10 將 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）在 65℃ 失活 3 min。
2.11 如果不需要立即使用，可將擴(kuò)增后的 DNA 放在 4℃ 短期保存或放置在-20℃長期保存。擴(kuò)增后的 DNA 產(chǎn)量一般在 40 μg 每 50μL 反應(yīng)，并且需要按照一定的適當(dāng)比例進(jìn)行稀釋。光學(xué)濃度（OD）測定會(huì)高估擴(kuò)增 DNA 的產(chǎn)量。
注意事項(xiàng)
1. 該操作步驟針對(duì)各種來源的單細(xì)胞擴(kuò)增而優(yōu)化的，比如分選細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞以及細(xì)胞系等。該操作步驟不適用于經(jīng)福爾馬林或其他交聯(lián)試劑固定過的細(xì)胞，如來源于福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣本的激光顯微切割單細(xì)胞樣本。
2. 大約 40μg 的 DNA 產(chǎn)物也會(huì)存在于經(jīng)過單細(xì)胞擴(kuò)增反應(yīng)的陰性（無模板）對(duì)照中，這些產(chǎn)品是反應(yīng)體系中引物二聚體經(jīng)過隨機(jī)延伸而得到的高分子量擴(kuò)增產(chǎn)物。這些 DNA 并不會(huì)影響實(shí)際擴(kuò)增樣本的質(zhì)量，也不會(huì)在下游檢測過程中產(chǎn)生陽性結(jié)果。
3. 其他樣本類型也適用于此方法，包括：
4. 除了全基因組擴(kuò)增，基于 MDA 的技術(shù)也支持靶向區(qū)域擴(kuò)增，如針對(duì)線粒體 DNA 的特異性擴(kuò)增。
