Sanger測序

sanger是英國生物化學(xué)家，1918年8月13日生于英格蘭格洛斯特夏郡，在劍橋大學(xué)圣· 約翰學(xué)院獲哲學(xué)博士學(xué)位，畢業(yè)后到知名的劍橋醫(yī)學(xué)研究會分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作。Sanger的工作主要研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，特別是研究測定胰鳥素分子的結(jié)構(gòu)，成功地測定了胰鳥素的精細(xì)結(jié)構(gòu)，因而獲得了1958年的諾貝爾化學(xué)獎。

60年代后他致力于核糖核酸（RNA）和（脫氧核糖核酸）DNA的結(jié)構(gòu)研究，利用酶解圖譜法確定了RNA中各種堿基的排列順序和DNA中核甙酸的排列順序，所以1980年再度獲諾貝爾化學(xué)獎。

Sanger酶學(xué)法的原理[2]即用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑，通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進(jìn)行分離的方法。測序引物與單鏈DNA模板分子結(jié)合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應(yīng)分四組進(jìn)行，每一組分別用四種ddNTP中的一種來進(jìn)行終止，再用PAGE分析四組樣品。

雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3’－OH基團(tuán)，所以可被用作鏈終止試劑。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。

以該法為基礎(chǔ)，Sanger后來對它進(jìn)行了許多改進(jìn)，使之更適合實(shí)際操作，為后來的大規(guī)模測序提供了技術(shù)支持，其中一個重要改進(jìn)是利用單鏈DNA噬菌體載體將隨機(jī)打斷的DNA片斷分別測序，在拼成完整DNA。

在1980年發(fā)表的論文中，他提出將小片斷的DNA在ssDNA噬菌體中的克隆與末端終止法結(jié)合可以提高測序速度。將限制性內(nèi)切酶酶切得到的DNA隨機(jī)片斷，利用一段連接寡聚核苷酸插入修飾過的噬菌體M13mp2的EcoRI位點(diǎn)，培養(yǎng)收集重組噬菌體，并分離DNA。

用來自噬菌體載體的“側(cè)翼引物”通過鏈末端終止法來測每個插入的DNA的序列。該法在積累數(shù)據(jù)方面迅速，簡便，人類線粒體DNA中較大的限制性酶的片斷Mbol(2771個核苷酸)就是用這種方法測得的。

sanger的酶法測序技術(shù)是今天大規(guī)模基因組測序的基礎(chǔ)。DNA測序，測定組成人類染色體30億對堿基的宏大工程，是人類基因組計劃較大的挑戰(zhàn)。達(dá)到這個目標(biāo)將幫助我們揭示人體兩萬多個基因的秘密。基因組序列圖譜將成為21世紀(jì)的科學(xué)家探索人類生物學(xué)和其他更加復(fù)雜的現(xiàn)象的有力工具。

隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，基因組測序的步伐也越來越快，在人類基因組計劃完成后，其他模式生物的基因組測序工作也開展起來，基因組數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)以指數(shù)形式迅速增長。這些數(shù)據(jù)為廣大的科研工作者提供了方便，并促進(jìn)了多種新研究方法的產(chǎn)生。蛋白質(zhì)組學(xué)也在其推動下迅速發(fā)展起來，DNA序列為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)提供了參考。