雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

一、 檢測(cè)原理

全基因合成miR潛在結(jié)合位點(diǎn)上下游~500bp（LncRNA、circRNA或mRNA的3’UTR）野生形式WT及結(jié)合位點(diǎn)的突變形式Mut，克隆到psiCHECK-2多克隆位點(diǎn)處（1640-1674）（圖1），然后與miR的mimics/NC共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞測(cè)定熒光素酶讀值即可。

圖1 雙熒光素酶載體示意圖.

二、 載體構(gòu)建與Mimics合成

1. 構(gòu)建WT miR潛在結(jié)合位點(diǎn)到psiCHECK-2載體，命名為WT；

2.構(gòu)建Mut miR潛在結(jié)合位點(diǎn)到psiCHECK-2載體，命名為Mut（突變模式：A/T與G/C互變）；

3.合成待測(cè)miR的Mimmics及陰性對(duì)照NC。

三、 實(shí)驗(yàn)分組信息

四、 具體實(shí)驗(yàn)步驟：

(一) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟

1.事先準(zhǔn)備好用于轉(zhuǎn)染的分到96孔板中的293T 細(xì)胞和目的質(zhì)粒，待細(xì)胞密度達(dá)到50%-70%為宜。

2.將10 ml DMEM與0.16 mg的lncRNA (circRNA/3’UTR)/Mut目的質(zhì)粒以及5 pmol的miR/Negative.Control（N.C）Mimics充分混勻后室溫放置（溶液A）；然后將10 ml DMEM與0.3 ml 的轉(zhuǎn)染試劑（轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品LipoFiter，濃度為0.8 mg/ml）充分混勻（溶液B），室溫放置5 min。

3.將溶液A與溶液B充分混勻，室溫放置20 min。

4.轉(zhuǎn)染前為細(xì)胞換取新鮮培養(yǎng)基，之后將轉(zhuǎn)染混合物加入混勻。37℃，5% CO2培養(yǎng)。

5.轉(zhuǎn)染6 h后換取新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞檢測(cè)。

(二) 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作步驟

檢測(cè)試劑盒：Promega Dual-Luciferase system

1、將5′PLB (Passive Lysis Buffer)用蒸餾水稀釋至1′PLB，以96孔板每孔100 ml的量加入，用移液槍吹打打散細(xì)胞，置于室溫?fù)u床上緩慢搖15分鐘后，將細(xì)胞裂解液吸至1.5 ml離心管，4度12000 rpm （13200g）離心10 min，取上清移入新的管子；

2、96孔板中加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II)( Luciferase Assay Reagent, Progema)工作液100 ml；

3、加入20 ml細(xì)胞裂解液，移液槍吹打混勻2-3次，測(cè)定記錄Firefly luciferase值，此值為內(nèi)參值。

4、加入100 ml Stop & Glo? Reagent(Luciferase Assay Reagent, Progema)，移液槍吹打混勻2-3次，測(cè)定記錄Renilla luciferase值，此即為報(bào)告基因發(fā)光值。

五、 預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果