定位突變質粒缺口修復技術和等位基因修復技術

材料與儀器

酵母菌株
帶選擇標記的YRp或YCp質粒 適當的限制性內切核酸酶 相應選擇標記突變的酵母菌 質粒標記的選擇培養基平板
培養皿

步驟

1）將目的基因亞克隆到帶恰當的選擇標記的YRp或YCp質粒上。

2) 在基因內部的兩個限制酶酶切位點上切割以產生缺口，在缺口的兩側各留下40?200bP的同源區域，將得到的質粒片段進行凝膠純化。缺口或切口盡可能靠近突變

位點。

3) 如果用于致突變，通過PCR制備所需的致突變片段。如果是用來拯救或定位染色體等位基因，進行步驟4。

4) 將1μg帶缺口的質粒DNA和PCR產生的片段共同轉化入帶適當標記的酵母菌中。 如果是用缺口修復來拯救基因組等位基因，就單獨轉化帶缺口的質粒。

5) 將轉化子接種在專用于質粒標記選擇平板上，鑒別成功修復的結果。對于恢復或定位染色體等位基因，利用質粒分離技術鑒別選擇標記不穩定的轉化子。 如果突變正好位于缺口區域內，突變將會被修復的質粒攜帶。當突變位于缺口的附近時，其結果取決于交叉發生在什么部位。突變距離缺口區域越遠，含有突變的質粒就會越少。

6) 如果以PCR為基礎的突變作為突變發生的方案，篩選具有突變表型的轉化子。