穿梭質(zhì)粒

材料與儀器

帶有一個非URA3選擇標(biāo)記YCp載體
缺失成分平板+Ura 含有5-FOA YCp質(zhì)粒選擇性培養(yǎng)基的平板 YPD平板 YIP5載體
培養(yǎng)皿

步驟

1) 構(gòu)建染色體上重要基因被破壞的單倍體菌株以及含有完整重要基因和URA3選擇標(biāo) 記的YEp或YCp質(zhì)粒。

2) 對于誘發(fā)突變，將重要基因亞克隆到帶有不同選擇標(biāo)記的YCp載體上， 將大約10?20μg DNA采用羥胺或其他技術(shù)進(jìn)行誘變。或者將一個重要基因的突變衍生物克隆到Y(jié)Cp載體上。

3) 用乙酸鋰法將其轉(zhuǎn)化入第1步中的菌株，利用添加了尿嘧啶的缺失成分平板選擇 YCp質(zhì)粒，在許可溫度下進(jìn)行培養(yǎng)（一般為25℃)。在尿嘧啶存在的情況下，生長周期降低了對YEp質(zhì)粒的選擇性，也就是在每個轉(zhuǎn)化菌落中，一部分細(xì)胞已丟失了（攜帶重要基因非突變拷貝的）質(zhì)粒。但是應(yīng)注意任何攜帶有來自于YCp質(zhì)粒的未突變基因拷貝的轉(zhuǎn)化子不能失去YEp載體。

4) 將每個轉(zhuǎn)化平板都影印接種到兩塊含有5-FOA的平板上，同樣保持對YCp的選擇 性。將一塊平板在許可溫度下培養(yǎng)，另一塊在非許可溫度下培養(yǎng)（一般為36℃)。 作為對照，將每個轉(zhuǎn)化平板都影印兩個YPD平板并在相同的兩個溫度下培養(yǎng)。

5) 收集那些在許可溫度下產(chǎn)生Ura—乳突而在非許可溫度下不產(chǎn)生乳突的菌落（并在YPD培養(yǎng)基平板上在兩種溫度下都能正常生長），將它們劃線接種以產(chǎn)生單菌落。

6) 對每一個候選菌株檢驗約6個菌落，看它們在兩種溫度下是否都能產(chǎn)生乳突。

7) 對于每一個在步驟6中已經(jīng)檢驗過的溫敏突變候選株，通過在保持YCp篩選的平板 上劃線的方法，回收在許可溫度下5-F0A平板上的Ura—乳突。從這些菌株（現(xiàn)在這些菌株應(yīng)當(dāng)只含有YCp質(zhì)粒）分離質(zhì)粒，將它們轉(zhuǎn)化到大腸桿菌

8) 將帶有溫敏突變的基因亞克隆到Y(jié)IP5質(zhì)粒中，通過移換技術(shù)將這一突變基因引入染色體。

注意事項

影印通過檢測一部分菌落是否丟失了 Ura+YEp質(zhì)粒來區(qū)分不同種類的轉(zhuǎn)化子，Ura-的細(xì)胞表現(xiàn)為5-FOAr,因而從大多數(shù)Ura+的菌落背景中呈乳突狀生長。攜帶有來自于YCp質(zhì)粒的未突變基因拷貝的轉(zhuǎn)化子在兩種溫度下都會表現(xiàn)出Ura-乳突，而攜帶有來自于YCp的溫度敏感突變的轉(zhuǎn)化子只能在許可溫度下才產(chǎn)生Ura_乳突。攜帶有無效突變基因的轉(zhuǎn)化子在任何溫度下都不會產(chǎn)生乳突。