微生物分離純化實驗-簡易單孢子分離法
原理
簡易單孢子分離法是一種不需顯微單孢操作器，直接在普通顯微鏡下利用低倍鏡分離單孢子的方法。它采用很細的毛細管吸取較稀的萌發的孢子懸浮液滴在培養皿蓋的內壁上，在低倍鏡下逐個檢查微滴。將只含有一個萌發孢子的微滴放一小塊營養瓊脂片，使其發育成微菌落。再將微菌落轉移到培養基中，即可獲得僅由單個孢子發育而成的純培養。
材料與儀器
米曲霉
無菌水 4% 水瓊脂
查氏瓊脂培養基 無菌三角瓶 玻璃珠 玻璃管 鑷子 無菌漏斗 棉花 接種環 無菌培養皿 無菌小刀 顯微鏡 記號筆
步驟
1. 厚壁磨口毛細滴管的制備
截取一段玻璃管，在火焰上燒紅所要拉細的區域，然后用鑷子夾住其尖端，在火焰上拉成很細的毛細管。從尖端適當的部位割斷，用砂輪或砂紙仔細濕磨。使管口平整，光滑。
2. 分離小室的準備
取無菌培養皿（D9 cm）倒入約 10 ml 4% 水瓊脂作保濕劑。在皿蓋上用記號筆（最好用紅色）如圖所示畫方格。待凝后倒置于 37℃ 恒溫箱烘數小時。使皿蓋干燥。
3. 萌發孢子懸液的制備
3.1 孢子懸液的制備
用接種環挑取米曲霉孢子數環接入盛有 10 ml 查氏培養液及玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩 5~10 min。使孢子充分散開。
3.2 過濾
用無菌漏斗（塞棉花）或自制的過濾裝置將上述充分散開的孢子液過濾，收集過濾液。
3.3 孢子萌發
將孢子過濾液用血球計數板測定孢子的濃度，再用查氏培養液調整孢子液至 0.5~1.5 × 106 個孢子 1 毫升后置 28℃ 培養 8 h。
3.4 點樣
用無菌自制的厚壁磨口毛細滴管吸取萌發孢子液少許，快速輕巧地點在培養皿的內壁的方格內中，每微滴面積略小于顯微鏡低倍鏡視野。依次將每方格點上萌發孢子液，成為分離小室最后將皿蓋小心快速翻過來，蓋在原來的平板上。
3.5 鏡檢
按圖 VII-7 所示，將點樣的分離小室平板放在顯微鏡鏡臺上，用低倍鏡逐個檢查皿蓋內壁上的微滴．如果觀察到某微滴內只有一個萌發孢子時用記號筆在皿蓋上作上記號。
3.6 加薄片培養基
取少量查氏瓊脂培養基倒入無菌培養皿（培養限先置 45℃ 預熱）中制成薄層平板。待其凝固后用無菌小刀片將平板瓊脂切成若干小片（其面積應小于培養皿蓋上所畫小方格的面積），然后挑一小片放在作有記號的單孢子微滴上，其他依次進行，最后蓋好皿蓋。
3.7 培養
將分離小室平板置 28℃ 培養 24 h，直至單孢子形成微菌落。
3.8 轉種
用無菌微型小刀小心地挑取長有微菌落的瓊脂薄片移至新鮮的查氏培養基斜面或液體培養中，置 28℃ 培養 4～7d。即可獲得由單孢子發育面成的純培養。
注意事項
毛細滴管要求達到點樣時出液均勻、快速，每微升孢子懸液約點 50 微滴。每滴的大小略小于低倍鏡的視野。
