離心洗脫法
材料與儀器
細(xì)胞
洗脫離心機(jī) 培養(yǎng)基 錐形瓶 洗脫儀
步驟
1. 準(zhǔn)備下列儀器：
洗脫離心機(jī)
裝有一個(gè)大容器中的 20 L 培養(yǎng)基，含 0.5%~1% 血清和抗生素，置于室溫
20 個(gè) 1 L 的錐形瓶，用以收集各洗脫組分
2. 至少提前 10 天開始培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行離心洗脫時(shí)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期且不會(huì)達(dá)到太大的飽和度。
3. 按洗脫儀提供的說明，安裝轉(zhuǎn)頭和離心機(jī)，加入去離心水啟動(dòng)整個(gè)系統(tǒng)。
4. 細(xì)胞裝在 1 L 的瓶子中，600 g，離心 25 分鐘。
5. 倒盡上清，合并所有的細(xì)胞沉淀至一支 50 ml 規(guī)格的管中，終體積 40~50 ml。
6. 將上述濃縮的細(xì)胞懸液通過一支裝有 18# 針頭的注射器，打散細(xì)胞團(tuán)塊。
7. 顯微鏡檢查細(xì)胞，如果有必要，用更小的針頭重復(fù)處理直至大于 95% 的是單細(xì)胞。
8. 往洗脫系統(tǒng)中泵入含 0.5%~1% FCS 的培養(yǎng)基。
9. 參考洗脫儀附帶的說明進(jìn)行適當(dāng)?shù)募?xì)胞注入操作。
10. 首先分離個(gè)體小的 G1 期細(xì)胞，慢慢提高流速。
11. 當(dāng)細(xì)胞室內(nèi)看起來似乎沒有什么細(xì)胞時(shí)，停止轉(zhuǎn)頭，維持流速，洗脫出殘余的細(xì)胞。
12. 一邊洗脫，一邊用 Channelyzer 計(jì)數(shù)細(xì)胞和測(cè)量細(xì)胞大小。洗脫完畢，有必要分析各組細(xì)胞所位于的細(xì)胞周期的哪一階段。
