四唑鹽（MTT）比色實(shí)驗(yàn)

原理

活細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490  nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。 

材料與儀器

細(xì)胞
D-Hanks液 牛血清 RPMI1640 雙抗 0.08%胰酶
凈化工作臺(tái) 離心機(jī) 恒溫水浴箱 冰箱 倒置相差顯微鏡 培養(yǎng)箱 吸管 玻璃瓶 培養(yǎng)瓶 廢液缸 吸頭 槍頭 膠塞 離心管 量加樣槍 紅血球計(jì)數(shù)板

步驟

一、接種細(xì)胞
1.  用0.08%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞。
2.  用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液。
3.  以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 ul。

二、培養(yǎng)細(xì)胞
1.  將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中。
2.  在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。（培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?/span>

三、呈色
1.  每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 ul，37℃孵箱中繼續(xù)孵育4 h。
2.  終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。
3.  對于懸浮生長的細(xì)胞，需離心（1000 rpm，5 min），然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
4.  每孔加入150 ul DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。

四、比色
1.  選擇490 nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。
2.  以時(shí)間為橫軸，光吸收值為終軸繪制細(xì)胞生長曲線。

注意事項(xiàng)

1.  選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，對每一種細(xì)胞都應(yīng)測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，然后確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間。

2.  避免血清干擾，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。

3.  設(shè)空白對照，與試驗(yàn)平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。最后比色時(shí)，以空白孔調(diào)零。