大鼠腦微血管內皮細胞原代培養實驗-酶消化法
原理
以大腦皮質為材料、酶消化及梯度離心分離腦微血管段并進行原代培養，成功地摸索出大鼠腦微血管內皮細胞分離和原代培養的方法，并獲得純度較高的腦微血管內皮細胞。
材料與儀器
SD大鼠
纖連蛋白 Ⅳ型膠原 明膠 肝素鈉 堿性成纖維細胞生長因子 青霉素 鏈霉素 NaHCO3 牛血清白蛋白 鼠尾膠 葡聚糖 DNA酶I D-Hanks'液 II型膠原酶
低溫離心機 離心管 移液槍
步驟
一、實驗材料準備
1. 實驗動物
每次實驗采用10只2-3周齡SD大鼠，雌雄均可，體重40~60 g。
2. 試劑
纖連蛋白(fibronectin)、Ⅳ型膠原、鼠尾膠、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)購自Sigma公司；D-Hanks'液、10xPBS按配方自制；II型膠原酶購自Worthington公司；明膠、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES購自Amresco公司；Percoll 購自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)購自GIBCO/BRL公司；肝素鈉、NaHCO3購自中國醫藥集團上海化學試劑公司；青、鏈霉素購自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)購自PAA Laboratories；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，膠原酶/分散酶(collagenase/dispase)購自Roche公司。
3. 儀器
低溫離心機(Centrifuge 5810 R，購自Eppendorf；Himac CR 22F，購自Hitachi)。
4. 試劑配制
（1）1 mg/ml鼠尾膠(用0.2%乙酸配制)，1%明膠(用D-Hanks'液配制)，1%II型膠原酶(用DMEM配制，用時稀釋成0.1%的濃度)，1%膠原酶/分散酶(用DMEM配制，用時稀釋成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20% BSA(用DMEM配制，調pH值至7.4后用0.45 um濾膜過濾除菌，較難過濾)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/ul)，以上試劑經0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝保存于-20℃。
（2）50%Percoll(配12 ml，需6 ml Percoll原液，0.67 ml 10xPBS，0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培養液(含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素鈉 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 ug/ml)，pH值調至7.4，過濾除菌后分裝保存于4 ℃，用時加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。
二、培養皿預處理
1. 涂布3種不同的基質，培養前一天加入1 ml 1%明膠于35 mm塑料培養皿，置于37 ℃培養箱過夜，接種前用D-Hanks'液漂洗2次。
2. 接種前4 h，加入鼠尾膠6~10 ug/cm2，在密閉的器皿里用氨氣熏5~10 min后，置于室溫1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。
3. 50 ul 0.1%纖連蛋白、50 ul 1 mg/ml Ⅳ 型膠原和400 ul雙蒸水混合后，加入到每個培養皿中涂布均勻后吸出，可涂布10個培養皿，置于37 ℃培養箱1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。
三、 腦微血管段的分離與腦微血管內皮細胞原代培養
1. 大鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。
2. 隨后將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培養皿中，用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。
3. 用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培養液，用虹膜剪將其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型膠原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大腦)混勻后37 ℃水浴消化1.5 h。
4. 離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入20% BSA懸浮混勻后離心(1000 g，20 min，4 ℃)或加入15%葡聚糖懸浮混勻后離心(4 000 rpm，20 min，4 ℃)，去除中上層神經組織及大血管，保留底部沉淀。
5. 加入2 ml 0.1%膠原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)懸浮混勻后37 ℃水浴消化1 h，離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入2 ml DMEM培養液懸浮后鋪于經離心形成連續梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。
6. 離心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗兩次(離心1 000 rpm，5 min，室溫)，去上清液。
7. 加入DMEM完全培養液(含20% FBS，100 μg/ml肝素鈉)懸浮后接種于涂布基質的35 mm一次性塑料培養皿(1.5 ml/培養皿，可接種1個培養皿/大腦)，置于37 ℃、5%CO2培養箱內靜置培養，12~24 h后換液，并加入1 ng/ml bFGF，隨后隔天換液。
四、鑒定方法
形態學、Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學檢測。
五、 結果
1. 細胞形態觀察
接種當時可見由圓形的內皮細胞構成的呈單枝狀或分枝狀的腦微血管段，并可見散在的單細胞及組織碎片(見圖1-1)；培養12~24 h后可見培養的細胞從貼壁的微血管段周圍長出，細胞呈短梭形，區域性單層生長，經換液后微血管段的殘余部分不斷減少，成纖維細胞、周細胞等雜細胞含量較少；隨著培養時間的延長，內皮細胞不斷增殖，可見"漩渦"分布，大約5~7天細胞達到融合，短梭形的內皮細胞占90%以上，但可見少量周細胞等雜細胞生長于內皮細胞單層表面或細胞克隆間隙(結果未顯示)。細胞生長過程見圖1，細胞接種于纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養皿。
2. 涂布不同基質的細胞生長情況
明膠及鼠尾膠涂布的培養皿微血管段貼壁時間較長，6 h時可見少量微血管段貼壁但無內皮細胞長出，12~24 h可見一些內皮細胞長出，24 h后腦微血管段完全貼壁并有較多的內皮細胞長出，兩者無明顯差異(見圖2-1~4)；纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養皿培養后6 h即可見微血管段貼壁并有一些內皮細胞長出，12~24 h內基本完全貼壁并有較多的內皮細胞長出(見圖2-5,6)。
3. 免疫組化鑒定
Ⅷ因子相關抗原免疫組化檢測可見培養的腦微血管內皮細胞的胞漿及核周有棕黃色著色，胞核呈空泡狀結構；對照染色為陰性。
注意事項
1. 自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。
2. 在超凈臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。
3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住，以防止細菌落入。
4. 操作前要洗手，進入超凈工作臺后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭。
5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼。金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，且冷卻后才能夾取組織。吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上的用品擺放要布局合理。
8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
常見問題
一、實驗討論
我們采用兩次酶消化、梯度離心分離得到腦微血管段，探索各種不同的培養條件，成功地進行了較純的大鼠腦微血管內皮細胞的原代培養，內皮細胞純度可達90%以上，而且細胞得率較高，10只動物可培養8~10個35 mm一次性塑料培養皿，培養面積大約80~100 cm2，與國內的一些方法[3~5]相比，細胞得率有明顯的提高。
由于新生鼠易于混有較多的雜細胞且大腦較小以及哺乳期大鼠優于超過1月齡的大鼠[9]，我們采用2~3- 12 - 丁香園細胞技術討論版電子文集 大鼠腦微血管內皮細胞培養周齡哺乳期的SD大鼠作為培養材料。腦微血管內皮細胞原代培養的關鍵是首先分離獲得純度較高且活力好的腦微血管段。在解剖過程中仔細去除軟腦膜、大血管及大腦白質收集大腦皮質，可減少成纖維細胞和平滑肌細胞的生長，對于提高內皮細胞的純度具有重要意義。由于膠原酶對內皮細胞的損傷較小，我們采用0.1%Ⅱ型膠原酶消化剪碎后的大腦皮質分散組織，同組織勻漿法[3,10]相比，酶消化法可避免組織勻漿對內皮細胞的損傷，從而有利于提高細胞的活力。經膠原酶消化后采用20% BSA或15%葡聚糖離心可分離腦微血管段與神經組織及大血管，得到底層的腦微血管段，這種方法被廣泛應用于腦微血管段的分離[5~9,11,12]，我們發現20% BSA較15%葡聚糖而言，其分離獲得的腦微血管段數量更多，而且腦微血管段狀態更好更易貼壁生長。由于周細胞是腦微血管內皮細胞原代培養中最常見的雜細胞，它會明顯抑制內皮細胞的生長[7]，因此原代培養中應盡量減少周細胞的數量，我們采用兩次酶消化方法[7]，控制兩次酶消化的時間，用0.1%膠原酶/消化酶分散出內皮細胞外圍的周細胞，最后采用一定濃度的連續梯度的Percoll分離以去除周細胞和紅細胞得到較純的腦微血管段。在酶消化過程中加入適量的DNA酶可分散消化過程中釋放的DNA所引起的微血管段凝結塊，有利于增加微血管段的得率。對于Percoll離心，我們嘗試了3個濃度(33%、45%及50%)后發現，濃度越大，腦微血管段離靠近離心管底的紅細胞及周細胞越遠，分離效果也越好，因此采用50% Percoll效果最好，并且最好采用水平轉頭的低溫離心機以提高離心效果。內皮細胞純化的其他方法有機械刮除法、克隆培養法、FACS分類法[13]、Thy1.1免疫反應殺傷法[7,14]、采用血漿來源的胎牛血清[8]、磁珠結合法[10]等，但是我們發現機械刮除法和克隆培養法并不適合大鼠腦微血管內皮細胞的純化，因為原代內皮細胞傳代后狀態不佳且易被雜細胞所抑制[7]，而后面幾種方法比較昂貴不予推薦；血漿來源的胎牛血清不含PDGF，不促進雜細胞的生長，但是其較昂貴，可選擇胎牛血清用于原代培養。
腦微血管內皮細胞的原代培養需要涂布明膠、鼠尾膠、纖連蛋白等基質以利于腦微血管段貼壁和內皮細胞的生長。我們嘗試不同基質后發現其對腦微血管段的貼壁和內皮細胞的生長作用不同，纖連蛋白/IV型膠原優于鼠尾膠，而鼠尾膠比明膠好，而且接種密度的要求前者比后兩者要低，后兩者需要達到一定密度才有利于腦微血管段貼壁。另外我們發現內皮細胞不易生長于玻片上，而較易生長于塑料培養皿上，這與文獻報道基本相符[8,14]。內皮細胞生長需要添加內皮細胞生長因子以促進內皮細胞的增殖抑制雜細胞的生長，我們采用bFGF可有效促進內皮細胞的生長，同時添加100 ug/ml肝素協同bFGF的作用并可抑制平滑肌細胞的生長[9]。同時為了保證內皮細胞的營養，并去除腦微血管段的殘余碎片，我們采用20% FBS的血清濃度并隔天換液。
我們培養的腦微血管內皮細胞呈短梭形，區域性單層生長，隨著培養時間的延長及內皮細胞的增殖，可見"漩渦狀"分布，約5~7天后，各區域之間可逐漸融合，其形態和生長特點與大多數文獻報道相似[6~9,11,12]。根據內皮細胞的短梭形的形態特點、Ⅷ因子相關抗原表達陽性可鑒定我們所培養的細胞確為腦微血管內皮細胞[3,5,8]。
我們的大鼠腦微血管內皮細胞體外培養模型的建立，對于研究腦內皮的生理、生化及藥理研究是一個較好的工具，同時可與星型膠質細胞共培養用于構建血腦屏障模型[1]。相信隨著技術方法的不斷改進，腦微血管內皮細胞體外培養的模型將逐漸接近于其在體特征，并被廣泛應用于相關研究[1]。
參考文獻
[1] Grant GA et al. News Physiol Sci, 1998, 13：287
[2] Panula P et al. Experientia, 1978, 34：95
[3] 王建民等。解剖學雜志，1998，21：495
[4] 許彥鋼等。微循環技術雜志，1997，2：63
[5] 錢志遠等。細胞生物學雜志，1999，21：42
[6] Kis B et al. Neuroreport, 2001, 12：4139
[7] Szabo CA et al. Neurobiology (Bp), 1997, 5：1
[8] Abbott NJ et al. J Cell Sci, 1992, 103：23
[9] Gordon EL et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1991, 27A：312
[10] Diglio CA et al. Lab Invest, 1982, 46：554
[11] Rupnick MA et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1988, 24：435
[12] Ichikawa N et al. J Pharmacol Toxicol Methods, 1996, 36：45
[13] Scott PA et al. J Cell Sci, 1993, 105：269
[14] Domotor E et al. Neurochem Int, 1998, 33：473
