大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)-貼塊法
原理
貼塊法適用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)量低的、管徑較小血管的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，其方法較酶消化法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。
材料與儀器
雄性Wistar大鼠
DMEM 胎牛血清 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 肝素鈉 青鏈霉素 明膠 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液
手術(shù)器械 眼科剪 眼科鑷 培養(yǎng)皿 手術(shù)刀 培養(yǎng)瓶 CO2培養(yǎng)箱
步驟
1. 頸椎脫臼處死大鼠，將整個(gè)大鼠浸泡于75%乙醇中消毒約1 min。在無(wú)菌狀態(tài)下，逐層剪開(kāi)胸腔，分離取出主動(dòng)脈，放含無(wú)菌 D-Hanks’液培養(yǎng)皿中。
2. 用眼科剪、鑷盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織。然后，用含抗生素的D-Hanks’液沖洗血管的外表面及血管腔內(nèi)的凝血數(shù)次，再放入另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中。
3. 用眼科剪縱向剪開(kāi)血管，平展在培養(yǎng)皿中。用非常銳利的手術(shù)刀將其切成1 mm3大小的動(dòng)脈植 塊(或者用剪刀剪，依照個(gè)人習(xí)慣)，然后種植到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿(培養(yǎng)瓶或皿用1%明膠預(yù)置 37℃下過(guò)夜， 使用前2h 移入CO2培養(yǎng)箱中。用時(shí)可以先經(jīng)含 10%小牛血清的培養(yǎng)液沖洗)。將動(dòng)脈植塊的內(nèi)膜面與瓶底接觸，種植密度約為 1 塊/cm2 。
4. 置培養(yǎng)箱中靜置2 h(干貼壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培養(yǎng)液，液量以略蓋過(guò)動(dòng)脈植塊內(nèi)膜面，而又不使植塊漂浮為宜。24 h 后，更換培養(yǎng)液，加入 2-3 ml 培養(yǎng)液。
5. 72 h 左右的時(shí)候，當(dāng)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞充分長(zhǎng)出，而成纖維細(xì)胞剛要長(zhǎng)出的時(shí)候，將動(dòng)脈植塊除去，刮除成纖維細(xì)胞，換培養(yǎng)液1 次。以后每2 天換液一次，每次換1/2~1/3 的液量。繼續(xù)培養(yǎng) 8-10 d， 細(xì)胞融合成單層，即可傳代。
注意事項(xiàng)
1. 自取材開(kāi)始，保持所有組織細(xì)胞處于無(wú)菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。
2. 在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過(guò)久，以免溶液蒸發(fā)。
3. 凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住，以防止細(xì)菌落入。
4. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈工作臺(tái)后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭。
5. 點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼。金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，且冷卻后才能夾取組織。吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
6. 操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。
7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上的用品擺放要布局合理。
8. 瓶子開(kāi)口后要盡量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
常見(jiàn)問(wèn)題
一、實(shí)驗(yàn)討論
植塊培養(yǎng)法適用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)量低的、管徑較小血管的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，其方法較酶消化法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。但缺點(diǎn)使易混有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，前者的貼壁時(shí)間和內(nèi)皮接近，后者貼壁較內(nèi)皮慢，而且會(huì)被肝素所抑制。
而由于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)較快，隨著傳代次數(shù)越多，其污染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗。因而，抑制和減少成纖維細(xì)胞是大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵問(wèn)題。本法采用的方法是：
1. 在合適的時(shí)間去除動(dòng)脈塊，即當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)爬出，初具規(guī)模時(shí)(大概在72 h 左右的時(shí)候，按照本文的培養(yǎng)液條件，因?yàn)橛猩L(zhǎng)因子，內(nèi)皮容易爬出和增殖)，去除動(dòng)脈塊，并刮除成纖維細(xì)胞。
2. 使用含肝素的培養(yǎng)液(在培養(yǎng)液中加入100 U/ml 的肝素)，可使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高；
3. 高濃度的血清和50 μg/ml ECGF 可以充分地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而使內(nèi)皮細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞。另外，動(dòng)脈植塊干貼壁的時(shí)間不宜超過(guò)2 h，而加培養(yǎng)液這一步驟尤為關(guān)鍵，過(guò)少會(huì)使內(nèi)膜接觸不到培養(yǎng)液，過(guò)多則易使動(dòng)脈小塊漂浮，導(dǎo)致貼壁失敗。因此，干貼壁后加培養(yǎng)液，加入少量高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液(0.5-1 ml)，可以避免這些問(wèn)題。
組織塊貼塊的時(shí)候，不可避免會(huì)有一些塊貼的方向不是內(nèi)膜面，那么最后將爬不出內(nèi)皮，甚至長(zhǎng)出較多雜質(zhì)細(xì)胞，需刮除。
另外，部分塊即使大小合適，方向也正確，也可能爬不出來(lái)，去除組織塊的時(shí)候，應(yīng)該以大局為重，看到內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)爬出較多，而雜質(zhì)細(xì)胞也開(kāi)始爬出的時(shí)候，就要果斷地去除組織塊了。72 h 只是個(gè)大概的時(shí)間，初學(xué)者不可以拘泥。
