小鼠骨髓來源巨噬細胞分離培養(yǎng)
簡介
巨噬細胞是目前免疫學研究中的熱點細胞，它作為固有免疫的關鍵成分，在維持機體的穩(wěn)態(tài)，疾病的預防和治療等方面發(fā)揮至關重要的作用。這里以骨髓來源的巨噬細胞為例，以更加專業(yè)簡潔的分離培養(yǎng)方法，為更好地研究巨噬細胞的生物學功能打下基礎。
材料與儀器
【試劑】1640 培養(yǎng)基、75% 酒精、9% 生理鹽水、多聚賴氨酸包被液、紅細胞裂解液、巨噬細胞集落刺激因子；
【耗材】無菌剪刀、無菌鑷子、70 μm 細胞過濾器、細胞培養(yǎng)板；
步驟
（1）提前采用多聚賴氨酸包被實驗所需細胞培養(yǎng)板；
（2）小鼠頸椎脫臼處死，然后放入 75% 酒精中浸泡 3-5 min 后，將小鼠轉移到超凈臺上一個含有 PBS 皿上；迅速分離股骨和脛骨，盡可能多的去除附著的肌肉組織；
（3）9% 的生理鹽水浸泡股骨和脛骨，剪去兩端，暴露骨髓腔；
（4）生理鹽水沖洗骨髓腔，70 μm 細胞過濾器過濾骨髓沖洗液；
（5）離心，室溫 1200 rpm，5 min；
（6）棄掉上清，向離心管中加入紅細胞裂解液（ACK Lysis Buffer），用槍頭反復吹打沉淀，使紅細胞充分懸浮，紅細胞裂解，在冰上靜置 2 min，加入 1640 培養(yǎng)基，在室溫 1000 rpm 離心 5 min 條件下離心，后棄掉上清；
（7）用含有 10 ng/mL 的巨噬細胞集落刺激因子的 1640 完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種于 12 孔細胞培養(yǎng)板中；
（8）每隔兩天換液一次，仍用含有巨噬細胞集落刺激因子的 1640 完全培養(yǎng)基；
（9）以此方法，培養(yǎng)直至第六天，細胞分化為成熟的巨噬細胞，可用于后續(xù)實驗操作。
注意事項
（1）實驗前所有器械消毒，高壓滅菌，液體無菌過濾；
（2）生理鹽水沖洗骨髓腔時，要沖至骨髓腔發(fā)白；
（3）用于后續(xù)培養(yǎng)需保證全稱無菌操作；
（4）1640 完全培養(yǎng)基中加入巨噬細胞集落刺激因子，定向誘導分化。
