小鼠結腸固有層免疫細胞分離

原理

流式細胞術應用廣泛，是免疫表型及功能分析的常見實驗方法。而獲得高質量的單細胞懸液是流式實驗成功的關鍵因素。

本為以小鼠結腸固有層免疫細胞分離為例，對單細胞懸液的獲取方法進行簡述。

材料與儀器

剪刀、鑷子、精細鑷、黑色硅膠皿
無菌培養瓶、70 μm 的細胞過濾器、50 mL 的離心管
預消化液：5 mL的FBS（5%），1 mL 的 5 M EDTA（invitrogen，AM9260G）（5 mM），稀釋于預先配制好的 HBSS 中，定容至 100 mL，充分混勻，現用現配
酶消化液：15 g collagenase D，4 mg DNase Ⅰ，0.3 g dispaseⅡ 溶解于 100 mL 預熱的 HBSS/5% FBS 的溶液中，現用現配

步驟

（1）小鼠處死后迅速取出結腸，去除腸系膜，將結腸放置于含有冰冷PBS液的無菌培養皿中，沿腸系膜縱向剪開結腸，在PBS中劇烈搖晃，清洗結腸，去除腸腔內容物；

（2）將結腸固定在黑色硅膠皿上，精細鑷在體視顯微鏡下迅速分離黏膜層；

（3）無菌剪刀將結腸黏膜組織剪成約 1 mm 的碎片，將剪碎的黏膜組織轉移置于預熱的裝有不含鈣鎂的 HBSS（5% FBS和5 mM EDTA）溶液的無菌培養瓶中，37 ℃，250 rpm，震蕩 20 min，棄掉液體，重復兩次；

（4）第二次震蕩后，過濾，用濾紙吸去多余的液體（保證去除殘留的EDTA），將結腸轉移至 1.5 mL 的 EP 管中剪碎；

（5）將黏膜組織碎片轉移至含 20 mL 結腸固有層消化液（1.5 g/L collagenase D，40 mg/L DNase Ⅰ，3 g/L dispaseⅡ 溶解于不含鈣鎂的 HBSS 溶液）的無菌培養瓶中，37 ℃，250 rpm，消化 10-20 min；

（6）充分渦旋，70 μm 的細胞過濾器過濾，收集上清液至 50 mL 的離心管中，4 ℃，1500 rpm，離心 10 min；

（7）棄上清，將分離的細胞沉淀重新懸浮在冰不含鈣鎂的 HBSS/FBS 緩沖液中，樣本置于冰上，染色；

（8）用細胞染色液（cell staining buffer；BD Pharmingen TM）清洗細胞，4 ℃，2000 rpm，離心 5 min；

（9）根據細胞量加入適當體積的封閉抗體和熒光抗體，上機檢測。

注意事項