檢測未知抗原

原理

親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對生物素有非常高的親和力（結合常數高達1015M-1）。生物素很易與蛋白質（如抗體等）以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原（或抗體）分子的目的。

材料與儀器

生物素化抗體
酶標記的親和素

步驟

1.  包被抗體：用0.05 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液將已知抗體作適當稀釋，在每個聚苯乙烯酶標板的反應孔中加0.1 ml，于4 ℃過夜（18～24 h）。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min（簡稱洗滌，下同）。
2.  加樣：加入待檢樣品（未知抗原）或作適當稀釋的標準參考品于反應孔中，同時作空白孔、陰性和陽性孔對照。37 ℃孵育1 h，洗滌。
3.  加B-Ab：已作適當稀釋的生物素化抗體（B-Ab），每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～60 min。洗滌。
4.  加A-HRP：已作適當稀釋的辣根過氧化物酶標記的親和素（A-HRP），每孔加0.1 ml，37℃孵育30～45 min。洗滌4次。
5.  底物顯色：于上述各反應孔中加入臨時配制的TMB（或 OPD）底物應用液0.1 ml，于37 ℃孵育10～30 min。再加2 mol/L H2SO4 0.05 ml以終止反應。
6.  結果判定：目測或在ELISA比色儀上測 OD 值（見ELISA部分）。