LncRNA相關(guān)研究思路
LncRNA介紹
lncRNA在癌癥疾病方面的研究已逐漸深入，lncRNA的突變或失調(diào)與癌細(xì)胞的發(fā)生密切相關(guān)，廣大學(xué)者通多方面的研究來解釋兩者之間的關(guān)系，為疾病的診斷和潛在的藥物靶點(diǎn)提供了，新型靶向治療方案。
一、lncRNA的特點(diǎn)
（1）長度大于200nt的非編碼RNA，部分lncRNA含有polyA尾巴；
（2）部分lncRNA可與核糖體結(jié)合，但沒有或只有較弱的蛋白編碼能力；
（3）相對mRNA，lncRNA的保守性較低；
（4）lncRNA的表達(dá)具有組織特異性以及時間特性。
二、lncRNA的功能
lncRNA通過折疊形成一定的空間結(jié)構(gòu)與多種蛋白互作，也可通過堿基互補(bǔ)配對與其它核酸進(jìn)行識別，這種識別又可將蛋白引導(dǎo)至特定序列位點(diǎn)，使得lncRNA在發(fā)育和癌癥中的功能發(fā)揮途徑更加豐富。
LncRNA參與基因的表達(dá)調(diào)控，可從表觀修飾水平，轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮功能，主要的方式如下:
（1）結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，干擾其與promoter結(jié)合，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄；
（2）吸附miRNA，抑制其與mRNA結(jié)合，使得mRNA免于降解；
（3）作為蛋白互作的橋梁，影響蛋白多聚物的形成，調(diào)控蛋白活性；
（4）與mRNA配對結(jié)合，影響mRNA的穩(wěn)定性。
三、lncRNA序列的查找
通過NCBI網(wǎng)站可查找目的lncRNA的序列，具體方法如下：NCBI-Gene-輸入基因名稱-Search-選擇對應(yīng)物種基因-點(diǎn)擊進(jìn)去-往下拖，選擇NR編號，該序列即為lncRNA全長。
四、相關(guān)質(zhì)粒構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分析
（1）lncRNA的過表達(dá)
①普通表達(dá)載體：選用任何真核表達(dá)載體既可，如p0157/pCDNA3.1(+)，p23835/pEnCMV-EGFP-Linker-MCS等哺乳細(xì)胞載體。將目的lncRNA基因構(gòu)建到目的載體中，并轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如人293T細(xì)胞），通過藥性篩選以及傳代篩選，得到穩(wěn)定的的細(xì)胞株系；提取穩(wěn)定細(xì)胞株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測其相對表達(dá)量；
②慢病毒表達(dá)載體：選用任何可用于慢病毒表達(dá)的載體既可，如表達(dá)載體p0268/pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro，p0247/pLVX-Puro等，輔助包裝質(zhì)粒p0261/psPAX2，p0700/pRSV-Rev，p0264/pLP1，p0265/pLP2，p0266/pLP-VSVG等。將目的lncRNA基因構(gòu)建到目的載體中，與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中（如人293T細(xì)胞），培養(yǎng)一段時間后，檢測病毒滴度，一般通過熒光蛋白表達(dá)情況計(jì)算慢病毒滴度；并用抗生素進(jìn)行篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，通過顯微鏡觀察綠色熒光，獲得慢病毒感染的穩(wěn)定細(xì)胞株，并進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測其相對表達(dá)量。
（2）lncRNA的亞細(xì)胞定位：構(gòu)建熒光蛋白融合表達(dá)載體，如p0134/pEGFP-C1，p0151/pmCherry-C1等，通過FISH（Fluorescence in Situ Hybridization）驗(yàn)證其亞細(xì)胞定位。
（3）lncRNA的干擾表達(dá)：慢病毒干擾載體p0255/pLKO.1-EGFP，p0256/pLKO.1，p0684/pLVshRNA-EGFP(2A)Puro等，及輔助包裝質(zhì)粒p0261/psPAX2，p0700/pRSV-Rev，p0264/pLP1，p0265/pLP2，p0266/pLP-VSVG等。根據(jù)NCBI上的lncRNA序列設(shè)計(jì)干擾靶點(diǎn)，構(gòu)建帶目的序列的慢病毒干擾載體，后續(xù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒方法和病毒滴度檢測方法同慢病毒表達(dá)載體中的表達(dá)檢測。此干擾表達(dá)載體的構(gòu)建，需根據(jù)（2）中的定位結(jié)果進(jìn)行選擇合適的方法，一般RNAi只有在胞漿中才能發(fā)揮作用，而在細(xì)胞核中的無法被干擾，而目前研究的大多數(shù)lncRNA都是胞漿內(nèi)的功能驗(yàn)證，細(xì)胞核內(nèi)目前鮮見有報(bào)道。
（4）lncRNA與miRNA的相互作用：通過在線網(wǎng)站預(yù)測目的lncRNA與目的miRNA之間可能的結(jié)合位點(diǎn)，通過對靶位點(diǎn)的突變，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO，將目標(biāo)序列構(gòu)建到fluc的3UTR區(qū)，與miRNA的mimics或NC mimics（一個是誘導(dǎo)劑一個是抑制劑）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中（如人293T細(xì)胞），設(shè)置對照組不加任何miRNA試劑和無目標(biāo)序列的空載體，通過熒光值的變化來驗(yàn)證是否與靶位點(diǎn)結(jié)合從而調(diào)控基因的表達(dá)。
（5）lncRNA與蛋白的互作驗(yàn)證：通過網(wǎng)站來預(yù)測目的lncRNA可能互作的靶向蛋白及相關(guān)互作蛋白，或通過高通量測序結(jié)果，挖掘其中的lncRNA與mRNA的差異變化，進(jìn)而篩選興趣蛋白。根據(jù)此預(yù)測或測序分析結(jié)果，構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒：lncRNA和靶蛋白的慢病毒過表達(dá)載體及干擾表達(dá)載體，分別進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：通過RNA pull-down實(shí)驗(yàn)（lncRNA已知，靶蛋白未知，實(shí)驗(yàn)對象蛋白僅通過網(wǎng)站預(yù)測），用T7 RNA聚合酶標(biāo)記lncRNA實(shí)驗(yàn)組，與抗生蛋白鏈菌素磁珠混合過夜，富集的蛋白通過SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后選擇特異性蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測，或通過RT-qPCR靶向蛋白的相對表達(dá)量，分析lncRNA對靶向蛋白的結(jié)合能力；通過RIP（RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）實(shí)驗(yàn)（已知靶蛋白，不知lncRNA），加入靶向蛋白抗體和同型IgG抗體作為陰性對照，通過RT-qPCR靶向蛋白的表達(dá)量，分析靶向蛋白對lncRNA的結(jié)合能力；EMSA（凝膠遷移實(shí)驗(yàn)）來檢測已知的蛋白和lncRNA之間的互作關(guān)系，用標(biāo)記的RNA探針和靶蛋白共孵育，黨RNA-蛋白復(fù)合體形成后，用非變性聚丙烯酰胺凝膠分離兩者，來確定RNA結(jié)合蛋白的特異性。在此基礎(chǔ)上，可通過相關(guān)蛋白的信號通路，進(jìn)一步檢測其他蛋白的表達(dá)量，驗(yàn)證lncRNA的表達(dá)是否會在多個蛋白間相互作用影響。
（6）lncRNA的編碼能力的驗(yàn)證：構(gòu)建含有肽段的lncRNA載體，即lncRNA-連接肽（如FLAG等），檢測肽段是否有表達(dá)，可驗(yàn)證其是否有編碼能力。
（7）其他：通過lncRNA與mRNA的互作研究，也可通過兩者的過表達(dá)或敲低表達(dá)水平來觀察癌細(xì)胞的增殖和凋亡能力以及遷移能力，進(jìn)而為疾病的診斷提供潛在的藥物靶點(diǎn)。
