MTT 法檢測(cè)藥物對(duì)貼壁細(xì)胞的半抑制濃度

簡(jiǎn)介

MTT 又名噻唑藍(lán)【3-（4, 5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2, 5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，中文名為 3-（4, 5-二甲基-2-噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍(lán)】，是一種黃顏色染料，可用于檢測(cè)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)情況。

原理

活細(xì)胞線粒體中（原核細(xì)胞則位于細(xì)胞膜上）的琥珀酸脫氫酶 （Succinate dehydrogenase） 能夠?qū)⑼庠葱?MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜 （Formazan） 并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。

二甲基亞砜 （Dimethyl sulfoxide, DMSO） 能夠溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在 490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比，可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，定量評(píng)價(jià)供試藥物的毒性。根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)，計(jì)算可得供試藥物對(duì)細(xì)胞的半抑制濃度。

用途

廣泛應(yīng)用于藥物對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測(cè)定。

材料與儀器

（1）實(shí)驗(yàn)器材：

2 mL 離心管、50 mL 離心管

96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、10 μL 移液槍

200 μL 移液槍、1000 μL 移液槍

10 μL 槍頭、200 μL 槍頭、1000 μL 槍頭

CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜、離心管架

恒溫震蕩搖床、石英比色皿、酶標(biāo)儀

光學(xué)顯微鏡、多通道移液器（排槍）等

（2）試劑：

MTT、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS

DMSO 等。

（3）供試細(xì)胞和待測(cè)樣品：

生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞、待測(cè)藥物

步驟

（1）配制 MTT 和梯度濃度的藥物

a. PBS 磷酸緩沖液 （1 L，調(diào)節(jié) pH = 7.4）

b. MTT （5 mg/mL）：稱取 MTT 0.5 g，溶于 100 mL PBS 中，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃ 避光保存；

c. 待測(cè)藥物：稱取約 0.5 mg 待測(cè)藥物，用 DMSO 配成 2.56 mg/mL 的初始濃度，建議預(yù)實(shí)驗(yàn)稀釋的系列梯度濃度分別為 2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02 mg/mL（該濃度范圍針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室初篩的藥物活性所設(shè)，具體藥物濃度請(qǐng)根據(jù)自身實(shí)際情況進(jìn)行設(shè)立），后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果再選擇更精細(xì)的濃度；硫酸鏈霉素的濃度與待測(cè)藥物一致。

（2）細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：

a. 用 0.5% 的胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，待細(xì)胞即將脫離皿底時(shí)，加少量血清終止反應(yīng)，1000 rpm 離心 5 min，棄上清，將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基吹打混勻，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度至 5~10×104/mL；

b. 向 96 孔板的小孔中加入 100 μL 細(xì)胞懸液，每板鋪 8 組細(xì)胞，濃度設(shè)置分別為 3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000 個(gè)/孔（邊緣孔用無(wú)菌 PBS 填充），共鋪 4 板細(xì)胞；

c. 96 孔板放入 5% CO2 培養(yǎng)箱中，37 ℃ 培養(yǎng)，每 24 h 取出一塊板進(jìn)行檢測(cè)：

1） 每小孔加入 10 μL MTT溶液，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4~6 h；

2） 吸去小孔內(nèi)培養(yǎng)液（移液槍不要觸到底部的結(jié)晶）， 每孔加入 150 μL DMSO，搖床上低速振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解，之后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各小孔在波長(zhǎng) 490 nm 下的吸光值；

d. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）接入細(xì)胞：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后，向 96 孔板中加入 100 μL 細(xì)胞懸液，鋪板使細(xì)胞濃度為 1000~10000 個(gè)/孔（邊緣孔用無(wú)菌 PBS 填充）；

（4）共培養(yǎng)：96 孔板放入 5% CO2 培養(yǎng)箱中，37 ℃ 孵育至細(xì)胞貼壁后，加入一系列濃度梯度的藥物，溶劑對(duì)照為 DMSO，選擇相應(yīng)已知活性良好的藥物用作陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù) 3 次，繼續(xù)培養(yǎng) 24~72 h 后顯微鏡觀察；

（5）向 96 孔板的每個(gè)小孔中加入 20 uL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后觀察顯色情況，終止培養(yǎng)后，吸去小孔內(nèi)培養(yǎng)液，每小孔加入 150 uL DMSO，置搖床上低速振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 490 nm 處測(cè)量各孔的吸光值。

（6）半抑制濃度采用改良寇式法進(jìn)行計(jì)算，公式：1 g IC50 = Xm - I [P-（3 - Pm - Pn）/ 4]

Xm：1g 最大劑量

I：1g（最大劑量/相臨劑量）

P：陽(yáng)性反應(yīng)率之和

Pm：最大陽(yáng)性反應(yīng)率

Pn：最小陽(yáng)性反應(yīng)率

其中，最大陽(yáng)性反應(yīng)率是指最大抑制率，最小陽(yáng)性反應(yīng)率是指最小抑制率，藥物抑制率 = 1 - 加藥組 OD 值 / 對(duì)照組 OD 值，將所得數(shù)據(jù)代數(shù)計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)

1）MTT 建議現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝后 -20 ℃ 避光保存，若已經(jīng)變?yōu)榛揖G色，則不建議繼續(xù)使用；

2）要保證初始的鋪板密度一致，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，調(diào)整到鋪板所需密度，本實(shí)驗(yàn)方法中給出的范圍較大，不同細(xì)胞需要根據(jù)實(shí)際情況做出相應(yīng)調(diào)整，同樣地，起始藥物濃度范圍也需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)判斷；

3）96 孔板最邊緣小孔中的水分蒸發(fā)很快，容易導(dǎo)致藥物濃度變化，出現(xiàn)誤差較大，建議邊緣小孔用無(wú)菌 PBS 填充；

4）反應(yīng)結(jié)束后需要完全棄去小孔中的液體，本方法中的建議是用移液槍吸取，也可以倒扣 96 孔板用吸水紙吸去液體，兩種方法均須注意不要碰到小孔底的沉淀物。

常見(jiàn)問(wèn)題

對(duì)于未知藥物，加入 MTT 前需確認(rèn)該藥物是否會(huì)與 MTT 反應(yīng)，或本身具有較強(qiáng)的氧化還原性。如果該藥物成分尚未得到明確鑒定，建議用 PBS 清洗 2~3 次后再補(bǔ)加培養(yǎng)基，之后再加 MTT 溶液。