MTT 法檢測藥物對細(xì)菌的半抑制濃度

簡介

MTT 又名噻唑藍(lán)【3-（4 ,5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2, 5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，中文名為 3-（4, 5-二甲基-2-噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍(lán)】，是一種黃顏色染料，可用于檢測細(xì)胞的存活和生長情況。

原理

活細(xì)胞線粒體中（原核細(xì)胞則位于細(xì)胞膜上）的琥珀酸脫氫酶 （Succinate dehydrogenase） 能夠?qū)⑼庠葱?MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜 （Formazan） 并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。

二甲基亞砜 （Dimethyl sulfoxide, DMSO） 能夠溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在 490 nm 波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比，可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，定量評價供試藥物的毒性。根據(jù)檢測數(shù)據(jù)，計算可得供試藥物對細(xì)胞的半抑制濃度。

用途

廣泛應(yīng)用于藥物對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定。

材料與儀器

試劑：

MTT（噻唑藍(lán)）、LA 平板

LB 液體培養(yǎng)基、PBS、DMSO 等

供試菌株和待測樣品：

大腸桿菌 （Escherichia coli）

枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis） 

待測藥物、硫酸鏈霉素（陽性對照）

實驗器材：

2 mL 離心管、50 mL 離心管、96 孔板

10 μL 移液槍、200 μL 移液槍

1000 μL 移液槍、10 μL 槍頭

200 μL 槍頭、1000 μL 槍頭

血球計數(shù)板、離心管架、恒溫震蕩搖床

石英比色皿、酶標(biāo)儀

多通道移液器（排槍）等

步驟

待測藥物對細(xì)菌的細(xì)胞毒活性檢測（以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為例）的步驟如下：

（1）配制 MTT 和梯度濃度的藥物：

a. PBS 磷酸緩沖液 （1 L，調(diào)節(jié) pH = 7.4）

b. MTT （5 mg/mL）：稱取 MTT 0.5 g，溶于 100 mL PBS 中，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，4 ℃ 避光保存；

c. 待測藥物：稱取約 0.5 mg 待測藥物，用 DMSO 配成 2.56 mg/mL 的初始濃度，建議預(yù)實驗稀釋的系列梯度濃度分別為 2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02 mg/mL（該濃度范圍僅供參考，具體藥物濃度請根據(jù)自身實際情況進行設(shè)立），后根據(jù)實驗結(jié)果再選擇更精細(xì)的濃度；硫酸鏈霉素的濃度與待測藥物一致。

（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

a. 菌種活化：取相應(yīng)的斜面菌種各 1 支，無菌挑取、劃線接入 LA 平板，37 ℃ 黑暗倒置培養(yǎng) 12~14 h；

b. 菌種培養(yǎng)：確定細(xì)菌在平板上生長狀態(tài)無誤后，接入 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 、180 rpm 搖培 12~14 h 至渾濁；

c. 接種、孵育和檢測：分別吸取 1 mL 菌液至 20 mL LB液體培養(yǎng)基中，混勻后 37 ℃、180 rpm 搖培，依次按時間取出搖培 0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h 的菌液，紫外分光光度計在 600 nm 波長處測定菌液的OD值；

d. 繪制曲線：將所測得的一組 OD 值為縱坐標(biāo)、時間為橫坐標(biāo)，繪制出該菌的生長曲線。

（3）培養(yǎng)靶標(biāo)細(xì)菌：活化靶標(biāo)細(xì)菌，并將活化好的靶標(biāo)細(xì)菌接入 LB 液體培養(yǎng)基中，紫外分光光度計在 600 nm 波長處測定菌液的 OD 值，按照標(biāo)曲在超凈工作臺內(nèi)將其稀釋至 1×106 CFU/mL；

（4）共培養(yǎng)：超凈工作臺內(nèi)，在無菌的 96 孔板中的每個小孔中加入 95 μL 稀釋好的菌液和 5 μL 待測藥物，溶劑對照為 DMSO，陽性對照為硫酸鏈霉素溶液，每個處理重復(fù) 3 次，混合均勻后 37 ℃ 靜置培養(yǎng) 16~18 h；

（5）檢測：向 96 孔板的小孔內(nèi)加入 10 μL MTT 溶液，常溫顯色 4 h 后肉眼觀察其 MIC 值（最小抑菌濃度）。

將產(chǎn)生沉淀的 96 孔 板，在 1500 g 離心 20 min，棄去上清，每孔加入 150 μL 的 DMSO，搖板上振蕩 30 min 終止反應(yīng)并充分溶解沉淀。用酶標(biāo)儀檢測在 490 nm 波長處各孔的吸光值。

這里半抑制濃度采用改良寇式法進行計算，公式：

（6）1 g IC50 = Xm-I [P -（3 - Pm - Pn）/ 4]

Xm：1g 最大劑量

I：1g（最大劑量/相臨劑量）

P：陽性反應(yīng)率之和

Pm：最大陽性反應(yīng)率

Pn：最小陽性反應(yīng)率

其中，最大陽性反應(yīng)率是指最大抑制率，最小陽性反應(yīng)率是指最小抑制率，藥物抑制率 = 1 - 加藥組 OD 值 / 對照組 OD 值，將所得數(shù)據(jù)代數(shù)計算即可。

注意事項

1）MTT 建議現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝后 -20 ℃ 避光保存，若已經(jīng)變?yōu)榛揖G色，則不建議繼續(xù)使用；

2）96 孔板最邊緣小孔中的水分蒸發(fā)很快，容易導(dǎo)致藥物濃度變化，出現(xiàn)誤差較大，建議邊緣小孔用無菌 PBS 填充；

3）反應(yīng)結(jié)束后需要完全棄去小孔中的液體，本方法中的建議是用移液槍吸取，也可以倒扣 96 孔板用吸水紙吸去液體，兩種方法均須注意不要碰到小孔底的沉淀物。

常見問題

對于未知藥物，加入 MTT 前需確認(rèn)該藥物是否會與 MTT 反應(yīng)，或本身具有較強的氧化還原性。如果該藥物成分尚未得到明確鑒定，建議用 PBS 清洗 2~3 次后再補加培養(yǎng)基，之后再加 MTT 溶液。