RNAi實驗原理、方法和應用
近年來的研究表明，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。這種轉錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。
一、RNAi的分子機制
通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。
在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。
另外，還有研究證明含有啟動子區的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.
二、如何進行RNAi試驗(一)siRNA的設計
1. 在設計RNAi實驗時，可以先在以下網站進行目標序列的篩選：http://www.genesil.com/business/products/order2.htmhttp://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlhttp://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=453587102.RNAi目標序列的選取原則：
(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。
(2)將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。3.陰性對照 一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。4.目前已證實的siRNA可以在下面的網頁找到：http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.htmlhttp://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.htmlhttp://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published(二)siRNA的制備 目前為止較為常用的方法有通過化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。
體外制備
1.化學合成
許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。最適用于：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素
2.體外轉錄
以DNA Oligo為模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當的時間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。
3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA 其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要優點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因。現在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響。最適用于：快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療體內表達 前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。
4. siRNA表達載體 多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數月的時間，同時也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的。 siRNA表達載體的優點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達，其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩定。最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。
5. siRNA表達框架 siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子，一段發夾結構siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長效抑制的研究。這個方法的主要缺點是
①PCR產物很難轉染到細胞中
②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發現導致結果不理想。最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）
(三)siRNA的轉染 將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉導至真核細胞中的方法主要有以下幾種：
1.磷酸鈣共沉淀 將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離最優條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。
2.電穿孔法 電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異，據認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優化對于成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene
帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時轉染。4.機械法 轉染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉入細胞質或細胞核。基因槍使用高壓microprojectile將大分子導入細胞。5.陽離子脂質體試劑 在優化條件下將陽離子脂質體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質體。這些脂質體帶正電，可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。因此使用陽離子脂質體轉染的原理與以前利用中性脂質體轉染的原理不同。使用陽離子脂質體試劑，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物。據稱，一個約5kb的質粒會結合2-4個脂質體。被俘獲的DNA就會被導入培養的細胞。現存對DNA轉導原理的證據來源于內吞體和溶酶體。
為了達到高的轉染效率，在轉染實驗過程中，需要注意以下幾點：
1.純化siRNA 在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。
2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性 通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。
4.避免使用抗生素
Ambion公司推薦從細胞種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。
5.選擇合適的轉染試劑 針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。
6.通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件
對大多數細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。7.通過標記siRNA來優化實驗 熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。
三、RNAi的應用前景1. 研究基因功能的新工具
已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以隨意控制在發育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢，發現大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進對這些新基因功能的研究。與傳統的基因敲除技術相比，這一技術具有投入少，周期短，操作簡單等優勢，近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。2. 研究信號傳導通路的新途徑
聯合利用傳統的缺失突變技術和RNAi技術可以很容易地確定復雜的信號傳導途徑中不同基因的上下游關系，Clemensy等應用RNAi研究了果蠅細胞系中胰島素信息傳導途徑,取得了與已知胰島素信息傳導通路完全一致的結果,在此基礎上分析了DSH3PX1與DACK之間的關系, 證實了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技術較傳統的轉染實驗簡單、快速、重復性好，克服了轉染實驗中重組蛋白特異性聚集和轉染效率不高的缺點， 因此認為RNAi技術將可能成為研究細胞信號傳導通路的新途徑。3.開展基因治療的新策略
RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉座子活動，防止自私基因序列過量增殖等作用，因此可以利用RNAi現象產生抗病毒的植物和動物，并可利用不同病毒轉錄序列中高度同源區段相應的dsRNA抵抗多種病毒。 腫瘤是多個基因相互作用的基因網絡調控的結果，傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長, 而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性, 設計針對這一區段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產生多個基因同時剔除的表現，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。 盡管目前RNAi技術在哺乳動物中的應用還處于探索階段，但它在斑馬魚和老鼠等脊椎動物中的成功應用預示著RNAi將成為基因治療中重要的組成部分，人工合成的dsRNA寡聚藥物的開發將可能成為極具發展前途的新興產業。
RNAi技術在病毒性疾病和腫瘤治療中的應用前景
摘要 RNA干擾是內源性或外源性雙鏈RNA誘發的mRNA水平上的基因沉默機制，具有高度特異性。21 nt干擾性小RNA在哺乳動物細胞中可以誘導強有力的特異性RNAi作用，這一突破性研究進展開創了人類疾病治療的新天地，RNAi 技術用于人類疾病治療已受到極大關注，尤其在AIDS、乙肝和丙肝等病毒感染性疾病和腫瘤治療中的應用研究最為活躍和深入，并取得了令人鼓舞的成果。本文對siRNA的設計、制備，及其在病毒性疾病和腫瘤治療中的研究進展作一綜述。 關鍵詞：siRNA RNAi 腫瘤治療 HIV 病毒性肝炎 RNAi （RNA interference，RNAi）是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默機制，由內源性或外源性dsRNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發。dsRNA 在細胞內被切割成21-25nt 干擾性小RNA（small interfering RNA，siRNA）， siRNA介導識別并靶向切割同源性靶mRNA分子，從而導致該基因不表達[1]。RNAi發現僅短短5年的時間，由于其高效性和高度特異性，RNAi 成為頗為理想的細胞水平基因敲除工具，并迅速成為后基因組時代功能基因組學研究中不可或缺的重要手段。然而，由于長的dsRNA（38-1000bp）在哺乳動物細胞中產生非特異的基因表達抑制，使得RNAi 技術用于哺乳動物中的研究相對滯后。直至2001年，Tuschl研究組通過采取21 nt siRNA 在哺乳動物細胞中誘導了強有力的特異性RNA干擾作用[3]，這一突破性研究進展開創了人類疾病治療的新天地，在AIDS、乙肝和丙肝等病毒感染性疾病和腫瘤治療中的應用研究最為活躍和深入，并取得了令人鼓舞的成果。本文對siRNA的設計、制備，以及在病毒性疾病和腫瘤治療中的研究進展做一綜述。
siRNA的設計、制備
在哺乳動物細胞中引發特異的基因沉默最有效的siRNA是21 nt siRNA[3]，其中19個堿基互補，兩邊3? 端各有2個堿基突出（通常是AA或UU）。基因抑制的有效性關鍵在于siRNA靶基因序列片段的選擇，然而，目前為止人們并不知道mRNA的哪一個部位對siRNA更敏感。通常隨機選擇3-4個靶位點進行設計siRNA，然后根據體外實驗結果，篩選出最為有效的siRNA。考慮到mRNA 5? 端非編碼區（untranslated regions，UTRs）通常有豐富的調控蛋白結合位點，調控蛋白與目的mRNA UTR區結合后可能會影響RISC復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)與mRNA結合降低抑制效果，通常人們避開此區域設計siRNA，但也有研究者持相反態度。 選出合適的靶序列后要同Genebank中的編碼序列進行blast 序列分析是非常必要的，這可以避免與無關的mRNA序列同源[4]。目前有多種在線siRNA設計軟件可供使用，詳細情況請搜索相關網站（www.dharmacon.com, www.qiagen.com, www.ambion.com, ）。
化學合成法制備siRNA是目前最常用的方法，Dharmacon、QIAGEN 、Ambion等公司均可以提供高質量的化學合成siRNA，但費用昂貴。其他體外制備siRNA的方法還包括體外轉錄法和Rnase III（如Silencer siRNA Construction Kit，Ambion公司） 或Dicer 酶消化dsRNA法[5]。體外制備的siRNA需要專門的RNA轉染試劑將其轉到細胞內，在不同細胞內的轉染效率存在較大差異，在原代細胞和T淋巴細胞中的轉染效率低，轉染到細胞內后作用時間較短，不能持久抑制基因表達。針對以上不足，結合過去20多年基因治療的經驗，人們構建了各種siRNA 表達載體或病毒載體，siRNA通過轉染到細胞內的DNA模板轉錄而獲得，在細胞內形成發卡結構的小RNA（short hairpin RNA, shRNA）。siRNA病毒載體的應用研究是目前研究的熱點。目前RNAi常用的病毒載體包括逆轉錄病毒載體、慢病毒載體和腺病毒載體[6，7]。
RNAi 在抗病毒感染中的應用前景
1. RNAi 技術用于抗HIV治療 2001年Tuschl研究組的突破性研究開創了RNAi技術治療人類疾病的新途徑，siRNA迅速成為治療HIV的新武器。美國費城的Thomas Jefferson 大學生化及分子藥理研究所Roger J. Pomerantz博士指出：將這項新穎的技術應用于人類疾病的治療上可能有莫大的潛力。在AIDS的治療上，RNA干擾可能成為對抗HIV病毒感染、復制的最有利方式。人們針對HIV生活周期的不同階段設計了多種siRNA，針對HIV病毒gag、tat、rev、nef等基因的siRNA可用以控制病毒復制，針對宿主細胞的表面HIV受體基因的siRNA可用以控制病毒進入宿主細胞內，抑制病毒的感染過程[8]。
1.1 針對HIV基因組RNA的siRNA Jacque等針對HIV病毒基因組的長末端重復序列(long terminal repeat ,LTR)、病毒vif和nef基因，設計合成了siRNA。他們將siRNA和HIV前病毒DNA共同轉染CD4受體陽性的Hela細胞，病毒感染陽性細胞的比率同對照組相比降低了95%以上。諾貝爾生理醫學獎得主Philip Sharp博士研究組設計合成了針對HIV gag 基因的anti-gag siRNA。研究證實針對病毒基因組的gag區域的siRNA可以有效的將病毒的基因“沉默”，抑制HIV病毒的復制能力[9]。Bauer 研究組通過載體在細胞內表達anti-rev siRNA，可明顯降低HIV復制水平，作用持續時間達數天之久[10]。在體外細胞株培養條件下，人們利用RNAi技術成功的控制HIV在細胞內的復制能力，然而，將該項技術用于臨床治療尚有一定距離。首先，siRNA轉染到原代T淋巴細胞比較困難是anti-HIV siRNA在臨床應用上的一大障礙。其次，RNAi具有高度特異性，靶序列上一個堿基的差異即可導致抑制效果明顯不同，而HIV逆轉錄酶的錯配率較高（每個復制周期可達1/1000nt），可能會迅速產生病毒突變株逃避siRNA的抑制作用。再者，不同個體甚至同一個體內的HIV病毒基因組呈現序列復雜多樣性，給siRNA的設計帶來困難。
1.2 針對宿主細胞HIV受體的siRNA 由于HIV病毒基因組的復雜多樣性和易突變性，單獨針對某一病毒基因的siRNA可能無法達到令人滿意的抑制病毒復制的效果，采取針對宿主細胞HIV受體的siRNA以阻止病毒進入細胞內也許更具實用價值。CD4是HIV病毒與之結合并進入宿主細胞內的主要受體，Philip Sharp博士研究組發現，針對宿主細胞受體CD4的anti- CD4 siRNA可以有效抑制HIV病毒的感染能力，并進而影響其復制水平[10]。然而，CD4是人體正常免疫功能不可缺少的分子，它的表達抑制勢必影響細胞免疫功能。在以往的研究中發現，T細胞共同受體CCR5的突變可以有效的保護細胞免受HIV-1的攻擊，而不影響正常的免疫功能。由此可以設想針對CCR5、CCR4等共同受體的siRNA或許具有更大的意義。此外，我們可以針對HIV感染和復制的不同階段設計多種siRNA，多種siRNA聯合應用很可能增強病毒抑制效果，也可以同其他抗HIV的藥物合用。
2．RNAi技術用于治療其他病毒性疾病的研究 RNAi技術除用于抗HIV研究以外，還用于抗其他多種病毒的探索。它們包括乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒（influenza virus）、脊髓灰質炎病毒（poliovirus）等[11,12]。以上研究均取得了另人欣喜的體外病毒抑制作用，但體內清除病毒的效果尚須在動物實驗模型中進一步驗證。RNAi技術可能會給病毒治療帶來一場革命，但真正用于抗病毒治療還有待進一步驗證。
RNAi 在抗腫瘤治療中的應用前景
1.RNAi用于抑制癌基因表達
原癌基因是細胞基因組中的正常組成成分，在自然狀態下無致癌作用，主要作用是通過編碼生長因子、受體和細胞內信息傳遞物質調節正常細胞的生長、分裂和分化。原癌基因的活化主要包括點突變、插入突變、基因擴增和染色體重排。以上各種類型的活化的癌基因的mRNA均可以采取RNAi 技術得到抑制，從而抑制腫瘤的生長。
1.1 RNAi 技術用于敲除點突變激活的癌基因 RNAi 技術是敲除點突變激活的癌基因的理想武器。K- ras 基因成為第一個采用RNAi 技術敲除的癌基因。ras基因是目前已知在人類腫瘤中最普遍呈活化狀態的致癌基因，此基因的突變現象存在于30-50%的腫瘤組織中，在胰腺癌可達85%。突變的ras 基因與正常細胞中的野生型ras 基因通常只有一個堿基的不同，但由于RNAi 的高度特異性，可以針對腫瘤細胞中突變的ras產生抑制作用，而對正常細胞中的野生型ras不產生抑制作用。Agami研究組采用逆轉錄病毒載體shRNA表達系統不僅特異性地在體外抑制了CAPAN-1胰腺癌細胞內的K- ras 基因的表達，也成功的抑制了裸鼠移植瘤的生長[13]。
1.2 RNAi 技術用于抑制基因擴增 基因擴增是指原癌基因通過某種機制在原來染色體上復制出多個拷貝數，導致表達產物異常增多，細胞增殖。EGFR（erbB1）在乳腺癌和肺癌等多種上皮性腫瘤中發生基因擴增，在腫瘤發生中起重要作用。德國Jovin研究組通過化學合成的anti-erbB1 siRNA成功的抑制了A431細胞內erbB1的表達，導致細胞凋亡增加和腫瘤增殖減弱[14]。
1.3 RNAi 技術用于抑制融合基因表達
染色體重排是指癌基因從所在染色體的正常位置上易位至另一個染色體的某一位置上，使起調控發生改變轉為激活狀態，產生異常基因產物，導致細胞惡性增殖。BCR/ABL融合基因是定位于人9號染色體9q34上的C-ABL基因和22號染色體22q11 上的BCR基因發生t（9：22）易位，使相應的無關的基因發生融合而形成的，它是Ph 染色體的分子基礎，在慢性粒細胞性白血病（CML）發病中起到重要作用。Borkhardt等采用RNAi 技術成功的抑制了K562白血病細胞中的BCR/ABL融合基因mRNA的表達[15]。
2.RNAi用于抑制其他與腫瘤發生發展相關基因的表達
腫瘤發生發展過程中除癌基因激活外，還涉及到多種形式的基因改變。bcl-2 是與血液系統惡性腫瘤密切相關的抗凋亡基因，可以阻遏化療藥物誘導的腫瘤細胞的凋亡。raf-1和白血病的發生和耐藥性也有密切聯系。抑制bcl-2 和raf-1 mRNA的表達可以抑制白血病細胞的增殖[[16]。抑制腫瘤血管的生成是腫瘤治療的又一策略，anti- VEGF siRNA可以特異性的抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，抑制腫瘤的生長[17]。腫瘤的耐藥性和多藥耐藥基因（multidrug resistance，MDR）的表達有關，通過anti- MDR siRNA可以抑制細胞的耐藥產生[18]。
如何在體內實現靶基因siRNA轉移到所有腫瘤細胞并穩定持久的抑制癌基的表達是RNAi技術治療腫瘤的關鍵。此外，從目前RNAi的研究現狀來看，在哺乳動物細胞中，RNAi并不能完全阻斷基因的表達，尤其是異常高表達的基因[3], 這也將影響對腫瘤的治療療效。盡管如此，但RNAi的高效特異性抑制癌基因表達以及明顯優于反義核酸的效果的特征顯示: RNAi將是一項令人不可忽視的抗腫瘤新技術。
2002年12月20日, Small RNA & RNAi 被Science雜志評為年度十大科技成就之首，Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性進展，是生物醫學領域近20年來，可與人類基因組計劃（human genomics program，HGP）相提并論的最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以調節和關閉基因的表達，進而調控細胞的各種高級生命活動。人們對小RNA分子的深入研究必將大大推進基因功能的研究，更為各種病毒性疾病和腫瘤等疾病的根治，開辟新的治療途徑。Small RNA與RNAi的研究與應用，具有極其重要的理論和實際意義，它必將對生物學和醫學的發展產生深遠的影響。
