RNAi技術(shù)在植物基因功能研究中的應(yīng)用
摘要 RNAi技術(shù)是研究基因功能的重要工具。其原理是對(duì)某個(gè)已知基因，設(shè)計(jì)誘導(dǎo)其沉默的dsRNA，通過合適手段導(dǎo)入細(xì)胞或機(jī)體使產(chǎn)生干涉效應(yīng)的信號(hào)分子siRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)水平下降或完全沉默。通過基因表型變化，鑒定該基因功能。從RNAi的研究背景和作用機(jī)制出發(fā)，對(duì)近年來利用RNAi技術(shù)研究植物基因功能的概況、誘導(dǎo)方法和載體作一綜述。
1 RANi的研究背景
1998年，F(xiàn)ire等[1]發(fā)現(xiàn)，過去利用正反義RNA阻斷基因表達(dá)都是因體外制備的單鏈RNA中污染極少量雙鏈RNA（dsRNA）所引起的，并發(fā)現(xiàn)在線蟲中導(dǎo)入dsRNA，mRNA明顯減少，推論存在某種機(jī)制特異地破壞降解內(nèi)源mRNA，導(dǎo)致某個(gè)基因沉默，即轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。在此情況下，啟動(dòng)子是活躍的但不能正常積累mRNA。這種現(xiàn)象被稱為RNA干涉（RNAi）。研究表明RNAi現(xiàn)象廣泛存在大多數(shù)真核生物中，起到自行監(jiān)控細(xì)胞中異常的mRNA、封閉該基因表達(dá)、抵御病毒感染及阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。
RNAi技術(shù)是將人工合成或載體表達(dá)的小的雙鏈RNA（siRNA）導(dǎo)入真核細(xì)胞，促使內(nèi)源RNA降解，高效特異阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型，獲得功能喪失或降低的突變體。RNAi技術(shù)具有高度的特異性和高效的干擾活力，是研究基因功能的強(qiáng)有力的工具而被廣泛應(yīng)用。
2 RNAi的作用機(jī)制
對(duì)模式生物的研究發(fā)現(xiàn)[2]，生物體內(nèi)外源或內(nèi)源的dsRNA經(jīng)酶切，可形成具有5’末端磷酸基、3’末端羥基和2個(gè)突出的單鏈核苷酸的信號(hào)分子siRNA，誘發(fā)RNAi機(jī)制。最近研究中還發(fā)現(xiàn)，在植物中除了轉(zhuǎn)錄后水平沉默（PTGS），RNAi也能在基因的轉(zhuǎn)錄水平（TGS）上發(fā)揮作用。
2.1酶的作用
參與RNAi發(fā)生的Dicer酶特異識(shí)別dsRNA，該酶依賴ATP，能將轉(zhuǎn)基因和病毒感染等引入的dsRNA，逐步切割成含21-23個(gè)核苷酸siRNA，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)RNAi反應(yīng)。RNAi過程的另一種重要的酶是RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶（RdRP）。RdRP的作用，使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的dsRNA數(shù)量呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，RNAi效應(yīng)得以放大。故少量dsRNA可使大量靶mRNA大幅度下調(diào)。
2.2RNAi過程
dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，在Dicer酶作用下被裂解成siRNA，雙鏈解開為單鏈，并和某些蛋白質(zhì)相結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）。在ATP的作用下，活化解鏈siRNA指導(dǎo)活化的RISC分裂靶mRNA。另外，在RdRP作用下，以siRNA為模板合成mRNA互補(bǔ)鏈，結(jié)果mRNA變成dsRNA，在Dicer酶的作用下被切成siRNA，重復(fù)進(jìn)行分裂靶mRNA。
3 RNAi技術(shù)在植物基因功能方面的研究
RNAi被生物學(xué)家稱為生物體在基因組水平上的免疫系統(tǒng)，也為植物基因功能的研究提供了新的思路和技術(shù)平臺(tái)，即利用RNAi技術(shù)進(jìn)行逆向基因分析。針對(duì)某個(gè)已知的基因，設(shè)計(jì)可誘導(dǎo)其沉默的雙鏈RNA，通過合適的手段導(dǎo)入細(xì)胞或機(jī)體，使該基因表達(dá)水平下降或完全沉默。觀察基因表型的變化，鑒定基因在基因組中的功能。這僅僅是使表達(dá)暫時(shí)降低或抑制，基因的信息仍是完整的。
最初在植物中研究RNAi的實(shí)驗(yàn)是使水稻中報(bào)告基因GUS沉默，來比較正義鏈、反義鏈及dsRNA誘導(dǎo)RNAi效率的高低。近年來利用RNAi技術(shù)在水稻、擬南芥、蕓薹屬、油菜、煙草及棉花上，已經(jīng)進(jìn)行了一些基因功能驗(yàn)證的相關(guān)研究[3]。其中研究最深入的是應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模擬南芥功能基因組的分析，以獲得擬南芥全基因組高質(zhì)量的基因序列標(biāo)簽（GST）[4]。
3.1植物體中的RNAi誘導(dǎo)方法
研究表明，在植物體中，信號(hào)分子siRNA可通過植物的維管系統(tǒng)運(yùn)輸。通過韌皮部進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸或通過胞間連絲進(jìn)行細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)運(yùn)。將目標(biāo)基因特異性序列以正向和反方分別插入標(biāo)記基因或內(nèi)含子的5’端和3’端，再在一端連接一個(gè)啟動(dòng)子，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將反式重復(fù)的外源基因?qū)肷矬w，誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA（iphRNA），能產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的RNAi現(xiàn)象[5]，其誘導(dǎo)目的基因沉默效率高，適用性廣，應(yīng)用潛力大。dsRNA或iphRNA能通過以下幾種方法呈遞到植物體內(nèi)。
3.1.1微彈轟擊法。將dsRNA或含內(nèi)含子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（iphRNA）表達(dá)載體顯微注射入植物體內(nèi)。
3.1.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。將帶有能轉(zhuǎn)錄成ihpRNA的反式重復(fù)的外源基因的T-DNA質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)整合到植物基因組上。
3.1.3病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）。目標(biāo)序列整合入病毒基因序列，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化ihpRNA表達(dá)。
3.2相關(guān)的干涉載體
Helliwell及其同事利用Invitrogen公司的Gateway重組克隆技術(shù)，構(gòu)建高通量基因沉默的載體系列pHELLSGATE，
包括全部擬南芥基因組的ihpRNA轉(zhuǎn)基因系[7]。澳大利亞的CSIRO公司也構(gòu)建出多種適用于禾本科植物的RNAi載體——pHannibal和pKannibal質(zhì)粒載體系列[7]。還有用于高通量植物功能基因組構(gòu)建的載體系列，包括適合組成型表達(dá)、誘導(dǎo)型異常表達(dá)的GUS或GFP融合蛋白雙元載體，和以煙草花葉病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建的高通量VICS載體系列。新載體的開發(fā)加快了植物功能基因組的研究。
3.3RNAi為注釋和認(rèn)識(shí)同源基因及功能提供了快速、高效的鑒定方法
比較接近的物種，可通過比較基因組加快研究進(jìn)度。利用傳統(tǒng)基因敲除或反義RNA的方法使基因沉默來研究基因家族的功能，往往難以達(dá)到理想效果，但應(yīng)用RNi技術(shù)能更好地研究同源基因。Frankish[4]使用RNAi的方法，證實(shí)通過合理設(shè)計(jì)雙鏈RNA，可有效地同時(shí)沉默1個(gè)基因家族，為多倍體物種的功能基因組學(xué)研究指明了方向。
4 RNAi技術(shù)在植物功能基因組研究中的應(yīng)用展望及挑戰(zhàn)
RNAi現(xiàn)象在植物體內(nèi)能以孟德爾方式遺傳，高度的特異性高效干擾活力，使得RNAi技術(shù)在植物學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但RNAi技術(shù)應(yīng)用于高通量的植物功能基因組學(xué)的研究也有一定的限制。
首先，目的基因序列必須是已知，隨著基因組和EST測(cè)序計(jì)劃的增加，受序列方面的限制將會(huì)減少；其次，dsRNA限制了高通量方法的應(yīng)用，目前只有少數(shù)植物能被成功轉(zhuǎn)化，穩(wěn)定表達(dá)ihpRNA。
因此，必須改進(jìn)植物基因干涉載體的轉(zhuǎn)化方法，加快新載體的開發(fā)；第三，并非所有基因都可被沉默，表達(dá)水平低的基因RNAi現(xiàn)象不明顯。對(duì)多因一效基因或同源性較高的基因家族，干涉會(huì)同時(shí)作用這些基因，沉默表型難以鑒定；另外，基因被沉默的表型與轉(zhuǎn)基因時(shí)所引起的插入突變表型，有時(shí)難以區(qū)別。
RNAi作為后基因組時(shí)代基因功能驗(yàn)證和表達(dá)調(diào)控分析的新技術(shù)，有著不可估量的應(yīng)用價(jià)值。可以預(yù)見，隨著RNAi技術(shù)的不斷完善，植物基因功能的研究和應(yīng)用將取得更大成果。
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