CRISPR 技術進行細胞 TP53 基因敲除

實驗原理

TP53 是重要的抑癌基因。在多種腫瘤中都能發現 TP53 基因突變及功能喪失。我們將針對 TP53 基因設計的靶點構建到 pCas9/gRNA1 載體，轉染 293T 細胞，構建了 TP53 基因敲除 293T 細胞系。

1、本實驗基因敲除原理：pCas9/gRNA1 載體表達 gRNA 和 Cas9 蛋白。將靶點序列克隆到 pCas9/gRNA1 載體上，gRNA 將誘導 Cas9 蛋白對靶點 DNA 進行切割，造成 DNA 斷裂。細胞通過鄰端連接 ( nonhomologous end-joining) 修復重新連接 DNA，造成靶點附近 DNA 序列缺失突變。

Cas9 切割原理:

2、pTYNE 載體靶點驗證原理：將包括靶點在內的大約 200bp 基因組序列克隆到 pTYNE 載體。構建好的 pTYNE 載體與 pCas9/gRNA1 基因敲除載體共轉染 293T 細胞。如果靶點有效，基因敲除載體對 pTYNE 載體載體切割，經過細胞修復后 pTYNE 上移碼突變的 EGFP 基因得到修復，發出綠色熒光。

3、陽性細胞篩選原理：pCas9/gRNA1 載體本身不帶篩選標簽。我們用帶有嘌呤霉素和 EGFP 標簽的載體 pLV-EGFP（2A)puro 和 pCas9/gRNA1 載體共轉染，再用嘌呤霉素篩選轉染成功的細胞。

簡要步驟

設計靶點→構建 pCas9/gRNA1 載體→pTYNE 驗證靶點→pCas9/gRNA1 載體轉染 293T 細胞→挑選培養細胞克隆→測序驗證基因敲除

靶點設計和基因敲除載體構建

人 TP53 基因有多個 mRNA 和蛋白拷貝，2 個轉錄起始位點，以及多個翻譯位點。我們在 TP53 基因的第四外顯子設計了 2 個 CRISPR 基因敲除靶點，以實現對所有 TP53 蛋白的編輯。

靶點序列 1：acctgccctgtgcagctgt

靶點序列 2：ttgattccacacccccgcc

將靶點 1 和靶點 2 構建到 pCas9/gRNA1 載體，獲得針對 TP53 基因的 gRNA 基因敲除載體 pCas9/gRNA1-P531 和 pCas9/gRNA1-P532。構建方法同 pCas9/gRNA1 使用說明中的方法。

靶點驗證

1、pTYNE-53 驗證載體構建

為了驗證基因敲除靶點的效率，我們把 TP53 第四外顯子部分序列通過 XhoI、HindIII 酶切位點連接到 pTYNE 載體，通過 pTYNE 載體驗證靶點的切割效率。構建完成的載體命名為 pTYNE-53。

構建完成后 pTYNE-53 載體序列：

注： 黃色：CMV promoter；灰色：TP53 第四外顯子部分序列；綠色：EGFP 序列；下劃線：CRISPR 靶點

2、用 pTYNE-53 驗證靶點

1) 轉染前 24 小時將 293T 鋪到 24 孔板中。同時準備 3 個孔。

2) 按照下列體系制備 2 個質粒稀釋液

組 1（陰性對照） 組 2（靶點一） 組 3（靶點二）

pTYNE-53 0.4ug pTYNE-53 0.4ug pTYNE-53 0.4ug

pCas9/gRNA1 空載體 0.4ug pCas9/gRNA1-P531 0.4ug pCas9/gRNA1-P532 0.4ug

DMEM 培養基 X ul DMEM 培養基 X ul DMEM 培養基 X ul

總體積 50ul 總體積 50ul 總體積 50ul

3) 準備轉染試劑稀釋液：

Polyfect-V 轉染試劑 4.8ula

DMEM 培養基 145.2ul

4) 將質粒稀釋液和轉染試劑稀釋液分別混勻。取 50ul 轉染試劑稀釋液分別加入兩組質粒稀釋液中，充分混勻，室溫孵育 15 min。

5) 將轉染液加入 293T 細胞。

6) 48 小時后檢測 EGFP 熒光表達。

檢測結果顯示靶點一和靶點二均有效果，靶點一的效果優于靶點二。

TP53 基因敲除 293T 細胞篩選

實驗步驟

1) 轉染前 24 小時將 293T 鋪到 6 孔板中。

2) 按照下列體系制備質粒稀釋液

pCas9/gRNA1-P531 0.7ug

pLV-EGFP（2A）puro 0.1ug

DMEM 培養基 X ul

總體積 50ul

3) 準備轉染試劑稀釋液：

Polyfect-V 轉染試劑 1.6ul

DMEM 培養基 48.4ul

4) 將質粒稀釋液和轉染試劑稀釋液分別混勻。取 50ul 轉染試劑稀釋液分別加入兩組質粒稀釋液中，充分混勻，室溫孵育 15 min。

5) 將轉染液加入 293T 細胞。

6) 48 小時后加入 puromycin 至終濃度為 3ug/ml。

7）篩選 3 天后消化細胞，用有限稀釋法將細胞接種到 394 孔板，標記單個細胞的孔，做單克隆細胞培養。培養時不加 puromycin。

8）約 7-10 天，細胞形成克隆。消化細胞，將部分細胞繼續培養，部分細胞提取基因組 DNA 檢測 TP53 基因敲除結果。

克隆檢測結果

以細胞克隆提取出的基因組 DNA 為模板，PCR 擴增 TP53 第 4 外顯子基因序列，并測序。

測序的 20 個克隆結果如下：

單敲除細胞克隆 12 個

雙敲除細胞克隆 2 個

未突變細胞克隆 6 個

合計 20 個